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0 引 言
拒霉素是多酚蒽酮类抗生
素[1] ，自从Brockmann H于1951年从拒霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)分离鉴定拒霉素以后，人们相继从硫黄链霉菌（S. sulphureus）、黄麻链霉菌（S. corchorusii）、海洋白浅灰链霉菌（S. albogriseolus）、灰肉红链霉菌（S. griseoincarnatus）、橘橙链霉菌(S. Aurantiacus)、灰略红链霉菌(S. Griseorubens)、暗灰链霉菌(S. canus)等链霉菌中的代谢产物中分离获得了拒霉素，且发现其有多种生物活性。研究发现拒霉素对HIV-1蛋白酶有抑制作用[2,3] 。拒霉素能抑制RNA和蛋白质的合成[4] 。除此之外，拒霉素可以抑制细胞凋亡，体外实验表明，拒霉素对胃腺癌细胞（HMO2）和肝癌细胞（HepG2）有强烈的抑制作用[5] 。2013年，Zhang等[6] 发现拒霉素对稻瘟病病原菌稻梨孢(Magnaporthe grisea)和苹果壳囊孢(Valsa mali)有强的抑制作用，IC50 分别为3.8 μg/mL和1.1 μg/mL；Vijayabharathi等[7] 发现拒霉素对多种细菌如：枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis )，金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )及表皮葡萄球菌( S. epidermidis )等具有抑菌活性。Shiono等[8] 发现拒霉素对放线菌素D引起的细胞凋亡有抑制作用，同时能有效地清除超氧自由基。班万里等[9] 研究发现拒霉素对表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有较好的抑制活性。目前常采用的发酵工艺优化的方法提高抗生素产量，通过添加维生素提高次生代谢产物产量的报道极少，但也有成功案例。在细菌方面，有研究通过添加维生素使裂殖壶菌中DHA的产量提高了53.8
%[10] ；娄秀平等[11] 通过添加维生素使大肠杆菌（Escherichia coli）JN8中L-色氨酸的产量提高了27%；在真菌方面，韩钱松等[12] 通过添加维生素使竹黄菌(Shiaria bambusicola P.Henn.)中色素产量提高了75%；在放线菌方面，维生素可将生二素链霉菌( Streptomyces ambof aciens)中螺旋霉素产量提高30%[13] 。本研究采用添加维生素的方法使灰略红链霉菌TRM11107中拒霉素的产量从初始的37.47 mg/L提高到了806.79 mg/L，产量提高了21.5倍，不仅为抗生素类次生代谢产物发酵产量的提高提供了参考，更为拒霉素的开发利用奠定了基础。
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1 材料与方法
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1.1 仪器及试剂
主要仪器：制备液相仪（Waters255，Waters，美国）；高效液相色谱仪（LC-20AT，岛津，日本）。
药品：二氯甲烷、甲醇（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）、硅胶板（GF254，青岛海洋化工厂）、大孔吸附树脂、柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）、凝胶（Sephadex LH-20，Pharmacia）
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1.2 供试菌株及培养基
① 供试菌株：灰略红链霉菌TRM11107，分离自新疆生产建设兵团第一师十二团连作棉田。
② ISP4培养基：可溶性淀粉10 g，
K2 HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2 O 1.0 g，NaCl 1 g，(NH4 )2 SO4 2.0 g，CaCO3 1.0 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.5。③ AM6培养基：葡萄糖10 g，淀粉20 g，蛋白胨5 g，酵母浸膏5 g，碳酸钙5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.5。
④ ISP3培养基：燕麦粉20 g，NaCl 1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.5。
⑤ ISP3-豆粉培养基：燕麦粉20 g，大豆粉10 g，NaCl 1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.5。
⑥ 复合维生素母液为：21金维他（杭州民生健康药业有限公司）10片（8.04 g）溶于100 mL水。21金维他配方（每片）：维生素A（2 500 iu），维生素B1（2.5 mg），维生素B6 250 μg），烟酰胺（7.5 mg），胆碱（25 mg），维生素C（25 mg），赖氨酸（12.5 mg），铁（5 mg），钾（5 mg），铜（500 μg），锰（500 μg），维生素D（200 iu），维生素B2（2.5 mg），维生素B12（0.5 μg），泛酸钙（2.5 mg），肌醇（25 mg），维生素E（5 mg），磷酸氢钙（279 mg），镁（500 μg），碘（50 μg），锌（250 μg）。
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1.3 菌株TRM11107的16S rRNA鉴定
TRM11107经ISP4液体发酵后收集菌体，采用SDS-CTAB
法[14] 提取基因组DNA，应用引物27F（5 -AGAGTTTGATCCTGGCTC-3 ）和1492R（5 -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ）进行扩增放线菌的16S rRNA和测序。利用EzTaxone进行序列比对，进行菌株的初步鉴定，采用ClustalW法对分离获得的放线菌进行多重序列分析，软件MEGA构建系统发育树(neighbour-joining)。 -
1.4 TRM11107发酵初试
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1.4.1 制备发酵种子液
将菌株TRM11107接种至ISP4琼脂培养基上，37 ℃培养7 d，打取菌饼接种于ISP4液体培养基制备发酵种子液。采用500 mL三角瓶，装液量为150 mL，每瓶接种3个菌饼，pH值为7.5，150 r/min，37 ℃发酵4 d。
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1.4.2 预发酵
预发酵采用AM6、ISP3和ISP3-豆粉液体发酵，发酵体系为：500 mL三角瓶，装液量为150 mL，每瓶接种10 mL种子液，pH值为7.5，150 r/min，37 ℃发酵9 d。纱布过滤收集菌丝体，用3倍体积甲醇提取后进行HPLC检查。HPLC条件为色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6×250 mm）。0~30 min，0~100%甲醇梯度洗脱，30~40 min，100%甲醇等度洗脱，流速1 mL/min，进样量20 μL。
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1.4.3 TRM11107发酵及产物分离鉴定
采用ISP3液体培养基对S. griseorubens TRM11107进行发酵，发酵条件同1.4.2。发酵结束后菌丝体采用甲醇热回流提取，发酵液经大孔吸附树脂吸附，甲醇洗脱后与菌体提取物合并，浸膏采用柱色谱法进行分离纯化，产物根据其物理化学等性质，并通
过1 H NMR、13 C NMR、碳氢近程相关谱（HSQC）和碳氢远程相关谱（HMBC）谱图数据查询维谱数据库，并参考文献中的谱图数据确定化合物的结构。 -
1.5 拒霉素标准曲线制作
拒霉素甲醇溶液经全波长扫描获得最大吸收波长，在此波长下制作拒霉素标准曲线。称取结晶拒霉素5.49 mg溶解于1 mL甲醇中，然后逐一稀释0.5倍，配制浓度分别为0.275、0.138、0.069、0.034、0.017、0.009、0.004 mg/mL的拒霉素甲醇溶液。
HPLC条件：色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm， 4.6×250 mm）。时间及流动相，0~30 min，30%~100%甲醇梯度洗脱，30~40 min，100%甲醇等度洗脱，流速1 mL/min，进样量20 μL。以吸收峰的峰面积和拒霉素的浓度做标准曲线。
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1.6 复合维生素的添加对菌体生长及拒霉素产量的影响
以ISP3液体培养基为基本培养基，分别向发酵体系中添加不同量的维生素母液（分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL/L），发酵9 d后收集菌体测定湿重，然后甲醇热回流提取3次，HPLC检测，根据标准曲线计算拒霉素含量。
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2 结果与分析
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2.1 菌株TRM11107的16S rRNA鉴定
将PCR扩增获得的16S rRNA进行测序，对菌株TRM11107的16S rRNA基因序列进行BLAST比对，选取代表菌株，采用邻接法进行同源性比较并构建系统发育树，见图1。
由图1可以看出，菌株TRM11107与灰略红链霉菌NBRC 12780聚在同一分支上，且相似度达99.86%，由此确定菌株TRM11107为灰略红链霉菌（S. griseorubens）。
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2.2 三种发酵培养基预发酵结果
灰略红链霉菌TRM11107经AM6、ISP3和ISP3-豆粉三种液体培养基发酵，菌体用甲醇提取后HPLC检测，结果如图2。
图2 AM6（2）、ISP3（1）和ISP3-豆粉培养基（3）对TRM1117产抗影响
Fig.2 Effects of AM6(2)、ISP3(1)and ISP3-soybean powder medium(3) on TRM11107 producing antibiotics
由图2可以看出，菌株TRM11107在AM6培养中基本无代谢物产生，而在ISP3和ISP3-豆粉培养基中发酵的情况下，经HPLC检测在36 min处有明显的吸收。其中在ISP3培养基发酵下，吸收更为强烈，据此初步确定ISP3液体培养基较为适合TRM11107发酵产抗。
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2.3 菌株TRM11107在ISP3中发酵及产物分离鉴定
菌株TRM11107经ISP3发酵，最终分离获得两个化合物，一个为亮黄色化合物（11107-1），一个为红色化合物（11107-2）。
化合物11107-1：亮黄色，
C22 H16 O6 ，Rf= 0.3(石油醚∶丙酮=3∶1)。1 H NMR和13 C NMR信息为：1 H NMR(acetone-d6，500 MHz) δH11.91(1H，s，10-OH)，7.29(1H，s，H-11)，7.14(1H，s，H-8)，6.42(1H,s,H-4)，2.96(3H，s，H-14)，1.60(6H，s，H-12，13)，13 C NMR(acetone-d6，125MHz)δ205.6(C-2)，185.0(C-6)，171.0(C-3)，170.6(C-5)，168.7(C-7)，163.0(C-10)，153.3(C-11a)，152.8(C-9)，140.1(C-11c)，129.5(C-11d)，119.8(C-8)，117.4(C-9a)，115.2(C-11)，110.8(C-11b)，107.5(C-6a)，106.6(C-5a)，103.2(C-2a)，100.9(C-4)，46.7(C-1)，29.3(C-14)，26.4(C-12，13)。这与Kock等[15] 报道一致，确定为拒霉素，其结构如图3。化合物11107-2:红色粉末，
C19 H12 O6 ，Rf=0.3 (石油醚∶丙酮=1∶1)。1 H NMR和13 C NMR信息为：1 H NMR(acetone-d6,500 MHz) δ 14.61(1H, s, 11-OH), 12.24(1H, s, 1-OH), 11.24(1H, s, 3-OH), 10.62(1H, s, 8-OH), 7.93(1H, s, H-6), 7.20(1H, d, J=1.8, H-9), 7.14(1H, d, J=2.4, H-4), 7.00(1H, s, H-7), 6.58(1H, d, J=1.8, H-2), 2.83(3H, s, H-13);13 C NMR(acetone-d6,125 MHz) δ 188.9(C-12), 181.5(C-5), 166.6(C-1), 165.6(C-3), 164.7(C-8), 160.2(C-11), 141.9(C-6a), 140.4(C-10), 136.3(C-4a), 128.4(C-5a), 123.9(C-6), 122.0(C-9), 119.9(C-10a), 112.1(C-4), 110.1(C-12a), 108.6(C-2), 108.5(C-7), 107.0(C-11a), 24.9(C-13)。数据信息与Rohr等[16] 报道一致，确定为特曲霉素，其结构如图4。 -
2.4 HPLC法制作拒霉素标准曲线
化合物11107-1纯品结构鉴定为拒霉素，纯度99.6%，并以此纯品测定紫外特征吸收，结果如图5，表明拒霉素在267、289、318和455 nm下有吸收，最优吸收峰为455 nm。以拒霉素在455 nm下的吸收峰面积和对应的拒霉素的浓度做标准曲线，在浓度范围0~0.6 mg/mL下，拒霉素的浓度与峰面积成良好的线性关系（y=9 000 000x+57 054），R2值为0.995 56，可基于标准曲线测拒霉素含量。
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2.5 复合维生素对TRM生长量及拒霉素产量的影响
分别向ISP3发酵体系中添加浓度为0、16.1、32.2、48.2、64.3和80.4 mg/L的维生素母液，发酵9 d后其对菌体湿重与拒霉素产量影响如图6所示。
图6 维生素对TRM11107菌体生长及拒霉素产量的影响
Fig. 6 Effects of adding vitamin-mixture on the growth of mycelium and resistomycin production in TRM11107
注：a,b,c,d,e,f表示0.01水平下有显著差异
NOTE: Statistical significance in 0.01 level is marked with a,b,c, d, e, f
由图6可知，21金维他复合维生素对灰略红链霉菌TRM11107的菌体生长及拒霉素产生均有影响。其中对拒霉素产生影响尤为明显。就菌体生长而言，在0~64.3 mg/L浓度范围内维生素母液的添加可促进灰略红链霉菌TRM11107的生长，其湿重达到1.234 g/mL，但当浓度提高到64.3 mg/L时，其菌体生长量有所下降，为1.097 g/mL，随着维生素母液添加量增加到80.4 mg/L，菌体生长量有所恢复，达到了1.190 g/mL。拒霉素产量随着维生素的添加表现为先增加后降低，在维生素添加量为64.3 mg/L时达到最大，为806.79 mg/L，当维生素母液添加量增为80.4 mg/L，其产量却下降十分明显，仅为186.44 mg/L。总体看来维生素可以有效促进TRM11107的菌体生长及拒霉素产生，但是当添加64.3 mg/L维生素时，拒霉素产量最高，菌体生长量却有所下降，推测是拒霉素的大量积累对菌体的自身生长产生了抑制作用。
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3 讨 论
拒霉素虽然有良好的抗菌抗肿瘤等生物学活性，但从人们首次发现到目前近70年的时间内其应用一直局限于实验研究，在临床和实际农业生产病害防治中几乎没有应用，其原因可能与其产量较低有关。文献表明，目前发现的拒霉素产生菌中，产量最高的是2011年Vijayabharathi等发现的一株链霉菌——橘橙链霉菌（Streptomyces aurantiacus）AAA5，产量达52.5 mg/
L[17] 。因此探索拒霉素有效的高产方法显得尤为重要，本研究向ISP3发酵培养基中添加21金维他复合维生素母液，将灰略红链霉菌TRM11107中拒霉素产量从37.47 mg/L提高到了806.79 mg/L，产量提高了21.5倍，使得灰略红链霉菌TRM11107有望成为工业生产菌株，同时也使拒霉素从实验室研究走向实际生产成为了可能。通过维生素的添加促进微生物次生代谢产物积累的研究报道相对较少，但周立树
等[10] 、韩钱松等[12] 、叶蕊芳等[13] 的研究结果表明，维生素在提高细菌、真菌及放线菌次生代谢产物产量方面均有良好的作用。本研究也进一步证实了维生素在提高放线菌中抗生素产量中有着良好的作用，为后续的相关研究提供了有益的参考，不足的是维生素促进拒霉素大量积累的机理尚不清楚，还有待进一步深入研究。 -
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摘要
对棉花枯萎病原菌拮抗放线菌TRM11107进行16S rRNA基因鉴定，采用AM6、ISP3和ISP3-豆粉三种培养基探索其产抗条件并进行发酵，发酵产物经色谱分离和核磁共振（NMR）鉴定，采用添加复合维生素的方法提高放线菌TRM11107拒霉素的产量。结果表明，TRM11107为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）（相似度99.86%），在ISP3液体培养基中产抗明显，经分离鉴定为拒霉素（37.47 mg/L）和特曲霉素，向IS3P液体培养基中添加64.3 mg/L复合维生素可将拒霉素产量提高到806.79 mg/L，提高21.5倍。
Abstract
TRM11107, an antagonistic actinomycete strain to Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum which causes cotton wilt, was identified by 16S rRNA gene sequencing, the secondary metabolites were analysed in three different fermentation media (AM6、ISP3 and ISP3-soybean powder), the fermentation products were isolated and identified by column chromatography and NMR, and the quantity of resistomycin from TRM11107 was improved by adding vitamin complex into the fermentation system. The results showed that TRM11107 was Streptomyces griseorubens (similarity 99.86%), TRM11107 could produce more secondary metabolites in quantity in ISP3 liquid medium. In this fermentation system, the quantity of resistomycin could increase from 37.47 mg/L to 806.79 mg/L by adding vitamin complex(64.3 mg/L), and the yield increased by 21.5 times.
