0 引 言

抗生素的滥用导致许多致病菌出现耐药性，危害着人们的健康，因此，寻找新型活性物质迫在眉睫。放线菌是具有高G+C含量的革兰氏阳性细菌，因其能产生丰富的活性次生代谢产物而著名^[1]。据统计，在已报道的千万种抗生素中，半数以上是由放线菌产生^[2]。随着对土壤中放线菌的深入研究，寻找到新型活性放线菌的概率变得越来越小，因此研究者们将目光转向了植物内生放线菌这类尚未开发的资源。植物内生放线菌是一类生活在健康宿主植物组织间隙或各种组织器官中而不引起植物组织出现侵染或明显病害症状的放线菌^[3]。大量研究表明，植物内生放线菌可产生丰富的抗菌、抗氧化、抗肿瘤活性代谢物质^[4]，其中，许多具有特殊的结构及新颖的活性。因此，植物内生放线菌是筛选天然化合物的重要资源。

近年来，特别是对药用植物内生放线菌代谢活性物质的研究方兴未艾。地锦草（Euphorbia humifusa）为大戟科（Euphorbiaceae）大戟属(Euphorbia）植物^[5]，是中医、维吾尔医常用药材，在《中国药典》和《本草纲目》中均有记载，现代研究表明地锦草具有抗氧化、抗菌、抗癌等药理作用。现有的对地锦草的研究主要集中在对其化学成分的药理学分析上^[6]，对地锦草内生菌的研究还未见文献报道。本研究以从地锦草中分离出的13株地锦草内生放线菌为研究材料，分析了菌株的酶活性、抑菌活性以及评估了抗生素合成潜力，并对发酵代谢粗产物的抑菌、抗氧化活性进行评价，以期为药用植物内生放线菌研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌：本实验室从地锦草中分离纯化的13株地锦草内生放线菌。

指示菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）等4株。由本实验室保存。

试剂：二苯代苦味酰基自由基 DPPH（Aladdin chemistry Co. Ltd，96%），维生素C，其余硫酸亚铁，双氧水，无水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，甲醇，吐温-80均为分析纯。PCR试剂及测序引物均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 培养基

NA培养基用于内生放线菌的活化及发酵液培养，LB培养基用于指示菌的培养。

MS基础培养基: 硝酸铵1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠1.0 g，氯化钙0.1 g，三氯化铁0.02 g，酵母膏0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7~7.2。

吐温-80培养基：1%吐温-80，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl₂·7H₂O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 仪器与设备

紫外分光光度仪（德国Eppendorf公司），Boxun洁净工作台（上海博讯实业有限公司），RE52-AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 生理生化特征

脂肪酶活性检测^[7]：将活化后的供试菌定点接种于吐温-80培养基中，28 °C培养5~7 d。若供试菌周围出现模糊的白色晕圈为阳性，否则为阴性。

纤维素分解酶活性检测：将MS培养基分装于大小一致的试管中，并制备（长度为18 cm,宽度1 cm）滤纸，灭菌。待试管冷却后将供试菌接种于MS培养基中，将滤纸下端浸泡于培养基中，28 °C培养15 d。观察浸泡在培养基中的滤纸，若滤纸被分解成纤维状、折断、变薄的则为阳性，否则为阴性。

淀粉水解酶活性检测：在NA培养基的基础上加入0.2%可溶性淀粉，高温高压灭菌30 min，倒平板备用。将供试菌点种于平板中，28 °C培养2~3 d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色。观察菌落周围若出现不变色透明圈为阳性，否则为阴性。

1.4.2 活性菌株筛选

按照蔡丽等^[8]的方法制备无菌发酵滤液。将已活化的指示菌用无菌水配成菌体浓度为每毫升1×10⁵~1×10⁶ cfu的菌悬液，取0.5 mL均匀涂布于NA培养基中，备用。准备直径为6 mm的滤纸片，高温高压灭菌，备用。将准备好的滤纸片充分浸泡在已备好的供试菌无菌发酵滤液中，用无菌镊子取出后风干，贴在含指示菌的平板中，28 °C培养24 h。每皿4片，每个菌3组重复，无菌蒸馏水作为空白对照，观察并记录抑菌圈大小。

1.4.3 生物合成基因PCR筛查

对13株内生菌进行3类抗生素合成关键酶基因的PCR筛查，包括I型聚酮合成酶(PKSI)，Ⅱ型聚酮合成酶(PKSⅡ)，非核糖体合成酶(NRPS)。使用特异性引物分别对菌株PKS-Ⅰ，PKS-Ⅱ，NRPS基因进行PCR扩增。引物序列见表1。PCR扩增条件见参考文献[9,10]，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR筛查所用引物及其对应生物合成基因

Table 1 Primers and relevant biosynthesis genes for PCR screening

引物对名称	正向引物(5’→3’)	反向引物(3’→5’)	基因名称	片段长度
K1F/M6R	TSAAGTCSAACATCGGBCA	CGCAGGTTSCSGTACCAGTA	PKS⁃I	1 200~1 400
A3F/A7R	GCSTACSYSATSTACACSTCSGG	SASGTCVCCSGTSCGGTAS	NRPS	700
ARO⁃PKS⁃F/ ARO⁃PKS⁃R	GGCAGCGGITTCGGCGGITTCCAG	CGITGTTIACIGCGTAGAACCAGGCG	PKS⁃Ⅱ	492~630

1.4.4 内生放线菌活性物质的初步提取

将1.4.2中筛选出的活性菌株无菌发酵滤液装入分液漏斗中，以1∶1的比例加入石油醚，盖好玻璃塞，反复振荡混匀后静置分层5 min。待溶液出现分层，将水相保留，重新装入分液漏斗中，以1∶1的比例加入乙酸乙酯，最后保留有机相。每个内生放线菌重复3次，将萃取出的产物40 °C减压浓缩至干，得活性物质粗提物。

1.4.5 活性物质粗提物抗菌测定

按1.4.2中的方法对活性物质粗提物进行抗菌活性测定，观察并记录抑菌圈大小，每组3次重复。

1.4.6 活性物质粗提物抗氧化测定

DPPH自由基清除能力测定参照傅玉鸿等^[11]的方法，并略作修改。准确称取1 g粗提物和抗坏血酸（Vc），用蒸馏水溶解并分别定容至100 mL，作为样品母液。准确称取DPPH，用无水乙醇配置成2×10^-4 mol/L的DPPH母液。分别吸取25 μL、50 μL、100 μL、200 μL的样品母液于EP管中，用无水乙醇补足至2 mL，加入2 mL DPPH母液，摇匀，避光反应30 min，测其517 nm处的吸光度A_i。重复上述操作，用无水乙醇代替DPPH母液，测其517 nm处吸光度A_j，DPPH与无水乙醇混合作为空白测其在517 nm处吸光度A₀。每组样本设3个重复，以抗坏血酸作阳性对照，各粗提物对DPPH自由基的清除率公式如下：

DPPH清除率= 1 - A i - A j / A 0 × 100 %

羟基自由基清除能力测定参照张新国等^[12]的方法，并略做修改。取1 mL不同浓度的样品液，依次加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、9 mmol/L水杨酸溶液1 mL、8.8 mmol/L双氧水1 mL，在37 °C水浴锅中反应15 min，测在510 nm处吸光度A_x。重复上述操作，用1 mL蒸馏水代替样品，测在510 nm处吸光度A₀。用1 mL 9 mmol/L水杨酸代替蒸馏水，测在510 nm处吸光度A_b。每组样品设3个重复，以抗坏血酸作阳性对照，各粗提物对羟基自由基清除能力公式如下：

·OH清除率= [ A 0 - ( A x - A b ) ] / A 0 × 100 %

1.4.7 内生菌L57的分类鉴定

形态观察：将L57划线接种于NA培养基中，培养24 h进行革兰氏染色，镜检观察菌落形态。

16S rDNA分子鉴定及系统发育分析：菌株L57经煮沸法^[13]提取总DNA后，采用细菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR扩增其16S rDNA基因。反应体系为50 μL：Mix taq 24 μL，正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，24 μL ddH₂O。PCR条件为：94 °C 3 min，94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min，72 °C 5 min，共34个循环。PCR产物送交上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用SeqMan软件进行拼接，并提交Ezbiocloud数据库（Ezbiocloud.net）进行同源性搜索。用Clustal X进行多序列比对，用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件采用邻接法聚类分析，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 内生放线菌生理生化特性测定结果

对13株地锦草内生放线菌进行生理生化特性测定结果如表2。结果表明，有6株菌具有淀粉酶活性，8株菌具有脂肪酶活性，8株菌具有纤维素酶活性。其中同时具有三种酶活性的菌株有2株，占15%，具有两种酶活性的菌株有6株，占16%，至少具有一种酶活性的菌株有4株，占30%，没有上述酶活性的菌株只有1株，占7%。

2.2 内生放线菌抗菌活性测定结果

13株地锦草内生放线菌抗菌活性测定结果如表3所示。测定结果表明，13株菌中有7株至少对一种致病菌表现出了抗性，阳性率达53%。其中L49、L57、G4对四种致病菌均具有抑制作用，抑菌效果十分明显。G26对三种致病菌有抑制作用，L43、L48、N25只对一种致病菌有抑制作用，在13株菌中L57的抗菌活性均明显高于其他菌株。挑取抑菌效果显著的L49、L57、G4、G26菌株进行后续试验。

2.3 生物合成基因检测

对13株内生菌进行3类生物合成关键酶基因PCR检测，包括I型聚酮合成酶(PKSI)，Ⅱ型聚酮合成酶，非核糖体合成酶(NRPS)，发现这13株菌均不含有这三类基因（未显示）。有趣的是，虽然PCR检测结果均为阴性，但13株菌中部分菌株在抑菌试验中却显示出较强抗菌能力。

2.4 内生放线菌活性物质粗提物抗菌测定结果

4株地锦草内生放线菌活性物质粗提物抗菌测定结果如表4。L57活性物质粗提物对于4种指示菌的抑菌效果依然十分明显（图1），对鲍曼不动杆菌的抑菌效果最突出，其平均抑菌圈直径达22.62 mm。其次L49活性物质粗提物对大肠杆菌及枯草芽胞杆菌表现出抑菌活性，G26活性物质粗提物只对大肠杆菌有抑菌活性，G4发酵液粗提物对4种指示菌均没有抑菌活性。

表4 地锦草内生放线菌发酵液粗提物抑菌活性结果

Table 4 The antibacterial activities of crude extract of the endophytic actinomycetes

菌种编号	抑菌结果
	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌	枯草芽胞杆菌	鲍曼不动杆菌
DHL57	14.38 ± 0.01	10.72 ± 1.13	13.36 ± 0.27	22.62 ± 0.17
DHL49	15.00 ± 1.28	-	11.82 ± 0.18	-
DHG4	-	-	-	-
DHG26	10.45 ± 0.12	-	-	-

注：-,未检测到抑菌活性；表中数据为平均数±标准差

NOTE: -, no inhibition; data in the table are x ¯ ±s

图1 内生放线菌L57发酵液粗提物对四种指示菌的抑菌作用

Fig. 1 The antimicrobial activities of crude extract of endophytic actinomycete L57

注：A:金黄色葡萄球菌；B：枯草芽胞杆菌；C:鲍曼不动杆菌；D：大肠杆菌

NOTE: A: S. aureus; B: B. subtilis ; C: A. baumannii ; D: E.coli

2.5 内生放线菌活性物质粗提物抗氧化测定结果

4株地锦草内生放线菌活性物质粗提物DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力测定结果如图2所示。在对DPPH自由基清除能力测定结果中，样品浓度在0.025~0.2 mg/mL时，Vc标准品和各粗提物对DPPH自由基的清除能力与样品浓度呈正比，具有剂量依赖性。各菌株发酵液粗提物对DPPH自由基的清除能力各不相同，其中L57的清除能力最显著，由图可看出L57的曲线与Vc标准品的曲线接近，当样品浓度在0.2 mg/mL时，清除率超过50%。L49在样品浓度为0.05 mg/mL时，清除率趋于稳定。虽然各个菌株发酵液粗提物的清除能力各不相同，但均表现出了一定的DPPH自由基清除能力，清除能力大小依次为L57>G4>L49>G26。

图2 四株地锦草内生放线菌发酵液粗提物抗氧化测定结果

Fig. 2 Evaluation on the antioxidant activity of extracts of the 4 endophytic actinomycetes

注：(a)对DPPH的清除能力 (b)对羟基自由基的清除能力

NOTE: (a) (b); (a) scavenging activities to DPPH-radical, (b) scavenging activities to hydroxyl radical

在对羟基自由基清除能力测定结果中，各菌株发酵液粗提物均表现出一定的羟基自由基清除能力，其中G26、G4的清除能力最显著，接近于Vc标准品，并且G26和G4的羟基自由基清除能力较DPPH自由基清除能力有显著差异。L49的发酵液粗提物在浓度为0.05~0.1 mg/mL时清除能力显著升高，随后趋于平缓。清除能力大小依次为G26>G4>L49>L57。

2.6 内生菌L57的分类鉴定

2.6.1 L57的形态特征

在NA培养基中30 °C培养2 d，L57形成边缘光滑清晰的淡橙色不透明菌落，分泌色素，质地粘稠，易挑起。显微镜观察显示细胞形态为棒状，无芽胞，革兰氏阳性。

2.6.2 16S rDNA分子鉴定及系统发育分析

对内生菌L57的16S rDNA进行PCR扩增获得1 412 bp的全序列，提交GenBank数据库注册序列号MK040532。调取与该菌株同源性的典型菌株序列，采用邻近相连法构建系统发育进化树，结果如图4所示，L57与食石油微杆菌（Microbacterium oleivorans）的遗传距离最小，以99%的自展支持率聚类在同一个亚分支上，这表明该菌株与食石油微杆菌的16S rDNA基因序列高度保守，未发生异化。结合形态观察结果，将其初步鉴定为食石油微杆菌。

图4 用邻近相连法构建的系统发育树

Fig. 4 The phylogenetic tree inferred by the neighbor-joining method

注：分支中的数字表示自展值；线段0.005为核酸替换率；发育分析在MEGA6中完成

NOTE: numbers at branches are bootstrap values; bar, 0.005 substitutions per nucleotide position; evolutionary analyses were conducted in MEGA6

3 讨 论

放线菌为重要的抗生素来源，寻找到具有开发利用价值的放线菌成为研究领域中的一大热点。内生放线菌与宿主的协同进化使得其具有与宿主相似或相同的生物学功能^[14]，因此可以说药用植物内生放线菌是发掘天然活性物质的资源宝库。从国内外的研究结果看，研究者们不断地从药用植物中筛选出具有活性的放线菌^[15]，其中一些放线菌还可产生重要的化合物^[16,17,18]，这为人类寻找新型天然产物提供了新的思路。地锦草作为一种传统中药，国内外对其化学成分和药理学功能研究较透彻，但还未见到有关地锦草内生放线菌的相关文献报道，因此，对其开展研究一方面填补了地锦草内生菌研究的空白，另一方面对推动中药研究具有重要意义。

本研究对13株地锦草内生放线菌的产酶特性、抑菌特性以及其次生代谢产物粗提物的抑菌，抗氧化活性进行了初步研究。内生菌在生长过程中会产生丰富的酶，如纤维素酶、脂肪酶，淀粉酶等，这些酶系作为生物催化剂，使复杂的化学反应高效快速地完成，内生菌在宿主体内生产各种酶可分解转化植物体内的活性成分，产生新的药效^[19]，与此同时，内生菌的产酶特性也可在工业生产中大量运用。检测内生菌抗菌及抗氧化的目的是为了能筛选出产生活性代谢产物的菌株，我们分别选取了两对G⁺, G^-指示菌，研究结果显示，在13株地锦草内生放线菌中，7株菌具有抑菌活性，但其中有3株菌在与病原菌拮抗的过程中逐渐失去抑菌圈，被病原菌覆盖，这说明其抑菌活性不稳定，这也是目前内生放线菌研究所遇到的瓶颈。有4株菌在进行了10次传代后依然表现出了显著抑菌活性，因此我们选取了该4株菌进行了后续研究。内生菌作为寄生在宿主体内的微生物，从宿主体内分离后可能没有了相应的应激环境，菌体会进入休眠状态，不再分泌抗生素类活性产物，因此通过基因筛查手段来分析其生物合成能力能快速准确地筛选出可生产抗生素的菌株，大大提高筛选效率，而具有活性合酶基因报告的候选菌株则可能得知其产物结构类型, 便于进一步分离分析。在本次研究中，13株地锦草内生放线菌未显示出抗生素合成潜力，但抑菌能力却十分明显。在后续实验中可使用其他活性筛选模型进行检测，如扩增糖肽类抗生素合成关键酶P450单加氧酶基因(oxyC)和重要的天然产物修饰酶卤化酶基因(halo)来进一步揭示放线菌的抗生素合成潜力。然而，在研究中为避免活性菌株的漏选，基因筛查并不能作为唯一的断定菌株是否有抑菌活性的标准。从抗氧化能力测定结果来看，地锦草内生放线菌也是寻找抗氧化活性物质的良好资源。经综合测定筛选出一株具有多种活性的内生放线菌，初步鉴定为食石油微杆菌，在下一步研究中，我们将进一步探讨其发酵液中活性物质的组分及单体结构，并深入了解其与宿主间的关系。

参考文献