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0 引 言
新疆不仅因“丝绸之路”闻名，而且以 “瓜果之乡” 著称，是古代联系欧亚的主要交通要
道[1] ，也是东西方生物多样性的过渡带。新疆特殊的地理与气候决定了其微生物资源的多样性，新疆地区丰富的瓜果资源为酵母生存提供了丰富的糖源，严酷的自然环境成为酵母进化的驱动力。现阶段，学者对桃园中酵母菌多样性的研究工作甚少，而对新疆本土桃园酵母菌多样性及功能酵母更是鲜有研究。蟠桃根际和非根际微生物种群结构及多样性都会随着树龄的增加发生变化，研究桃园不同树龄微生物多样性及种群结构，能合理调节土壤生态系统中有益微生物的种群和数量，发挥微生物对土壤生态功能维护的作用。酵母菌能产生的一些代谢产物，如胞外蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶
等[2] 在发酵生产工艺中发挥着重要的作用，其产生的挥发性物质，使食品具有独特的风味。新疆少数民族众多，其传统特色的发酵食品如奶啤、哈萨克传统奶酪、葡萄酒等具有独特的风味及口感，其营养价值及药用价值也一直受众多消费者的青睐，而新疆本土功能酵母菌资源的开发与利用也便成为了众多学者研究的焦点。本研究以石河子蟠桃园酵母菌为研究对象，通过传统的分离培养方法，经过形态学观察，生理生化检测以及分子生物学鉴定，对不同树龄的蟠桃园可培养酵母菌多样性及种群结构进行研究，为维护土壤微生态的稳定发挥重要作用；对功能酵母菌进行筛选，有望获得有应用潜力的酵母资源，为发酵产业提供更好的微生物资源。
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1 材料和方法
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1.1 主要材料
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1.1.1 主要仪器及试剂
① 仪器
超速离心机Minispin（Eppendorf）；体视显微镜SMZ800N（Nikon）；光学显微镜CX21（OLYMPUS）；PCR仪ProFlex（Applied Biosystems by Life Technologies）；DYY-7C型电泳仪（北京六一生物有限公司）； SWCJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）。
② 试剂
所用试剂有：葡萄糖、孟加拉红、蛋白胨、琼脂（北京索莱宝科技有限公司）、乳糖、半乳糖、海藻糖、松三糖、鼠李糖、核糖、棉子糖、麦芽糖、密二糖、菊粉、松三糖、甲基-吡喃葡萄糖、可溶性淀粉、纤维二糖、水杨苷、肌醇、乳酸钠、柠檬酸盐、葡萄糖醛、D-葡萄糖胺、鲸蜡烷、葡萄糖酸盐、糖酸盐。
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1.1.2 主要培养基
马铃薯葡萄糖分离培养基（PDA）、孟加拉红分离培养基的配置参照文献[3]；WL营养鉴别培养基、糖发酵测试基础培养基、碳源同化测试基础培养基、无维生素生长基础培养基、尿素琼脂培养基的配置均参照文献[4]；麦芽汁培养基（葡萄糖3 g，磷酸铵0.2 g，硫酸镁0.02 g琼脂2 g，麦芽汁100 mL）；产蛋白酶菌株筛选培养基参照文献[5]；富硒酵母筛选培养基参照文献[6]。
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1.2 方法
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1.2.1 样品采集
本研究采样地点主要集中在石河子143团，位于北纬44°10’~44°20’，东经85°10’~85°54’之间，分别选取3年，8年以及15年树龄的蟠桃树，随机采集完整健康的叶片，记作TY；3年、8年、15年树龄蟠桃树根际土壤分别记为：S4R、S5R、S1R，每个样点相隔30 cm；3年、8年、15年树龄蟠桃非根际土样分别记作：S4B、S5B、S1B，取样点距离桃树根1 m以上且各取样点之间相隔30 cm；每个土壤样品3个重复，共计19个样品。样品带回试验室后过2 mm筛后低温4 ℃保藏用于酵母菌的分离鉴定。
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1.2.2 酵母菌的分离纯化
将采集的蟠桃园土壤和叶片样品各 0.5 g 装于5 mL无菌水的试管中混匀，进行梯度稀释，得到的1×1
0-2 、1×10-3 和1×10-4 倍的稀释液，涂布到孟加拉红培养基平板上，放置1 h后将培养皿反转，于28 ℃培养48 h，根据菌落形态等特点挑选酵母菌单菌落，将一份单菌落接到PDA平板上用于后续试验，另一份接种至PDA斜面用于4 ℃保存。 -
1.2.3 酵母菌的鉴定
① 形态学和生理生化鉴定
酵母菌传统鉴定方法中，分离株在WL 鉴别营养培养基进行形态学鉴定，主要包括酵母菌菌落形态观察记录、细胞形态观察、繁殖方式记录、有无真假菌丝和子囊孢子形成
等[7] 。生理生化鉴定主要包括糖发酵试验，碳同化试验、无维生素生长培养基状况试验、产胞外类淀粉化合物试验，尿素酶试验，产DBB颜色反应试验、高渗透压生长试验、最高生长温度试验[8,9] 。② 酵母菌的分子生物学鉴定
DNA提取和PCR扩增：依据 WL 鉴别营养培养基的培养鉴定结果，每一种培养特征的菌株挑选 3~5 株，进行DNA提
取[10] 。对提取的酵母 26S r DNA D1/D2 区进行PCR扩增，选择通用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）[11] 。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃ 10 min，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。系统发育树的构建：将供试菌株PCR扩增片段的原始序列通过 BLAST软件，根据常用的GenBank 核酸序列数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索（BLAST search），与数据库中其他已知酵母菌相应序列进行比对，使用MEGA7.1 软件的邻接法方法构建系统发育树，初步确定供试菌株的生物学分类地位。
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1.2.4 功能酵母菌的筛选
① 富硒酵母筛选
挑取一环酵母菌株，在1 mL无菌水中适当稀释后，吸取0.1 mL并接种于含有硒浓度分别是0、10、15、20、25和30 μg/mL的筛选培养基上，每个稀释度涂布3个重复平板。恒温28 ℃条件下，倒置培养3~7 d，每天观察记录，颜色逐渐变红的菌株为筛选出的富硒酵母菌
株[6] 。② 蛋白酶酵母菌株筛选
将酵母菌株接种于产蛋白酶酵母筛选培养基上，28 ℃条件下，恒温培养箱培养7~10 d，每天观察记录，做3个重复，在灯光下检测，产生透明圈为产蛋白酶酵母菌，透明圈的大小显示菌株产蛋白酶能力。最后在 YPD 固体培养基上划线，16 ℃培养 1~7 d 记录菌落特
性[12] 。 -
2 结果与讨论
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2.1 酵母菌分布及多样性分析
通过PDA液体培养基富集、固体平板基分离纯化培养，从蟠桃园根际土壤，非根际土壤以及桃树叶片共7种材料中分离出可培养酵母菌共129株。参照酵母菌鉴定手册，通过WL 鉴别营养培养基进行形态学观察以及生理生化鉴定，并选取代表菌株进行分子生物学鉴定， PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在500~700 bp 之间出现特异性扩增条带，符合酵母菌目的片段理论预期值。经过送样测序，并建立系统发育树，如图1，结果显示它们从属于Barnettozyma属，假丝酵母属（Candida），隐球酵母属（Cryptococcus），Galactomyces属等12个属的17个种。将有效序列上传至GenBank数据库，获取序列登录号，如表1。
图1 基于 26S rDNA 基因的部分菌株系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree constructed of part of strains based on the 26S rDNA gene sequences
表1 酵母菌分离株同源性比对结果
Table 1 Results of homology comparison of yeast isolates
菌号 相似度 GenBank登录号 亲缘物种 亲缘物种中文名 S1R2⁃2 99% MG773365 Torulaspora delbrueckii 德布尔有孢圆酵母 S1R2⁃6 99% MG773346 Vanrija albida S1R1⁃12 99% MG773344 Galactomyces pseudocandidum S1B2⁃1 100% MG773337 Galactomyces geotrichum 半乳糖霉菌 S1B1⁃4 99% MG773331 Wickerhamomyces pijperi S1B2⁃8 99% MG773339 Candida tropicalis 热带假丝酵母 S1B3⁃1 99% MG773341 Kazachstania zonata S1B3⁃8 99% MG773348 Galactomyces candidum 白地霉 S4B1⁃2 99% MG773350 Hanseniaspora uvarum 葡萄有孢汉逊酵母 S4B1⁃3 99% MG773351 Candida jianshihensis 建世恒假丝酵母 S4R1⁃4 99% MG773363 Barnettozyma californica S4B2⁃9 99% MG773356 Wickerhamomyces anomalus 异常威克汉姆酵母 S5R1⁃1 99% MG773372 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 S5R3⁃1 99% MG773375 Gibellulopsis nigrescens S5B1⁃1 99% MG773368 Cryptococcus albidus 浅白隐球酵母 TY4 100% MG782880 Cryptococcus aerius 隐球酵母 TY12 99% MG782883 Geotrichum phurueaensis
由表2可知，分离得到的酵母菌菌株中子囊菌酵母为优势菌群，占总体分离属88%，分布于威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)， Vanrija属， Barnettozyma属，有孢圆酵母属(Torulaspora)等11个属的15个种。担子菌仅占总属的12%，分布于隐球酵母属（Cryptococcus）的2个种。这与Solis
等[13] 的研究干旱地区子囊菌酵母占优势的结果相一致。分离菌株经鉴定从属于有孢圆酵母属， Vanrija属，Galactomyces属，威克汉姆酵母属，假丝酵母属等12个属。其中优势属为威克汉姆酵母属，包括异常威克汉姆酵母(W. anomalus)和W. pijperi两个种，占总属的33%，优势种为异常威克汉姆酵母，所占总株数比例为17%。据报道,威克汉姆酵母属广泛分布于传统发酵产品、烂菜、青贮饲料、有机肥、动物粪便、各种乳制品和果园土壤等处[14] 。异常威克汉姆酵母和W. pijperi为酵母分离株的优势种，所占总数比例分别为17%和16%。Izawa等[15] 通过发酵研究W. pijperi产生的芳香化合物，发现这些物质都具有果香。果实的脱落和作为酵母菌的“天然温床”的土壤条件为其创造了良好生长环境，使得W. pijperi大量存在，成为桃园可培养酵母菌的优势种，而蟠桃的香甜果味可能与W. pijperi的存在有着密不可分的关系。表2 分离酵母菌种类及其样地分布
Table 2 Distribution of isolated yeast species
属名 种 名 15 年 3 年 8 年 叶 合计 S1R S1B S4R S4B S5R S5B TY 合 计 28 25 9 32 9 10 16 129 威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces） 异常威克汉姆酵母
（W. Anomalus）
5 1 5 10 - 1 - 22 W. pijperi - 12 - 2 - 7 - 21 有孢圆酵母属
（Torulaspora）
戴尔凯氏有孢圆酵母
（T. delbrueckii）
11 - 1 2 - - 14 Vanrija V. albida 11 - - 7 - - - 18 Galactomyces G. pseudocandidum 1 1 - 2 - - - 4 半乳糖霉菌
(G. geotrichum)
- 3 - - - - - 3 白地霉
(G. candidum)
- 3 - - 5 - - 8 隐球酵母属
（Cryptococcus）
隐球酵母
（C. aerius）
- - - - - - 6 6 浅白隐球酵母
(C. albidus)
- - - - - 2 - 2 假丝酵母属
（Candida）
热带假丝酵母
(C. tropicalis)
- 1 - - - - - 1 建世恒假丝酵母
(C. jianshihensis)
- - - 1 - - - 1 Barnettozyma B. californica - - 3 9 - - 7 19 有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora） 葡萄有孢汉逊酵母
(H.uvarum)
- - - 1 - - - 1 Kazachstania K. zonata - 4 - - - - 2 6 Gibellulopsis G. nigrescens - - - - 1 - - 1 酿酒酵母属
（Saccharomyces）
酿酒酵母
(S.cerevisiae)
- - - - 1 - - 1 地霉属
（Geotrichum）
G. phurueaensis - - - - - - 1 1
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2.2 蟠桃树根际、非根际土壤酵母多样性分析
由表2可知，从样品中共分离得到的129株酵母菌，其中根际土壤分离菌株46株均为子囊菌酵母，分别从属于威克汉姆酵母属，有孢圆酵母属，Galactomyces属，Vanrija属，Barnettozyma属，Gibellulopsis属，酿酒酵母属（Saccharomyces）等7属8个种，有孢圆酵母属、Vanrija为优势属，戴尔凯氏有孢圆酵母（T. delbrueckii）， V. albida为优势种，分别占根际酵母分离株的30%和24%。王
红[16] 研究显示戴尔凯氏有孢圆酵母为广布种，在山东、河北、安徽、甘肃、山西、新疆等省份均有分布。戴尔凯氏有孢圆酵母对高浓度糖具有很强的耐受性，是面团发酵制品中的起主导作用的酵母。Kaur等[17] 研究发现戴尔凯氏有孢圆酵母在特定条件下能够产生植酸酶，增加了蟠桃的营养成分，提高人体对蟠桃中微量元素的吸收。Alves-Araújo等[18] 从玉米和黑麦面包分离出戴尔凯氏有孢圆酵母并研究比较了与传统非酿酒酵母的潜在应用相关性。研究显示，根际微生物的数量和群落结构及其变化与植物生长发育有着重要的关系，直接影响植物对水分、养分吸收，也影响植物对不良环境的抵抗能力。非根际土壤中共分离得到酵母菌菌株67株，经鉴定分布于W. pijperi,异常威克汉姆酵母, B. californica, V. albida, Kazachstania zonata等12个种，其优势属是威克汉姆酵母属，占非根际酵母分离株的49.2%。W. pijperi为非根际土壤中的优势酵母种，所占比例为31.3%，W. pijperi分布于不同生境。Izawa
等[15] 研究发现，从花，叶片，腐烂的树种以及奶酪中均可分离得到W. pijperi，且这种酵母可以分解乳清，释放出芳香物质，这种能供提高乳清利用效率的酵母也被广泛的用于生产工艺中。叶片中分离酵母菌菌株16株，从属于Galactomyces属,Kazachstania属,Barnettozyma属,隐球酵母属等4属4种。优势种分别为戴尔凯氏有孢圆酵母, W. pijperi, B. californica,分别占叶片分离株的11%、16%、15%。不少学者已经证明W. pijperi可以产生芳香物质，增加果香及营养价值。Morais
等[19] 从大西洋雨林腐烂木材中分离到B. californica，可以利用D-木糖以及YNB-木聚糖产生乙醇。通过了解酵母菌的生物学特性，为生产工艺提供了新型环保资源。经过比较分析，我们发现桃园中根际土壤与非根际土壤中酵母菌多样性存在一定差异，共同分离得到的只有5个种，分别是异常威克汉姆酵母， V. albida， 白地霉， B. californica， G. pseudocandidum。但其所占比例均不同，异常威克汉姆酵母， V. albida，白地霉3个种在根际土壤中所占比例均高于非根际土壤，而B. californica和G. pseudocandidum 2个种在非根际土壤中所占比例较高。戴尔凯氏有孢圆酵母，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和Gibellulopsis nigrescens 3个种在根际土壤被分离得到，而在非根际土壤中未分离到，非根际土壤中独有的酵母菌种有W. pijperi， K. zonata， 半乳糖霉菌（Galactomyces geotrichum），浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）等7个种。研究结果显示非根际土壤中酵母菌菌群多样性比根际土壤高，这可能由于植物的根际效应影响微生物种群结多样性。
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2.3 不同树龄蟠桃树酵母种群组成结构
不同桃树树龄土壤中酵母菌多样性不同，如表2所示：结果显示，从3年树龄分离得到的酵母菌共41株，从属于7属8个种，8年树龄菌株共19株，从属于6属7个种，15年树龄菌株共53株，从属于7属9个种，且它们的优势属均从属于威克汉姆酵母属。结果进一步表明威克汉姆酵母属为桃园生境中的优势属，其生物学特征比起其他酵母属更适宜桃园生境的生长。
由图2可知，根际土壤可培养酵母菌多样性随树龄的增加表现出多样性增加的趋势，种水平上酵母菌在各自生境中所占比例不断增加， 15年树龄的蟠桃树根际明显已经形成了稳定的微生物种群结构，V. albida，异常威克汉姆酵母，戴尔凯氏有孢圆酵母已成为优势种群。由图2也可看出，非根际土壤比根际土壤微生物种群结构更为复杂，多样性更为丰富。Kennedy
等[20] 认为, 多样性越高，群落生产力和生态系统稳定性越高。随树龄的增长，桃树的抗逆性越高，可能与其周围酵母菌群落稳定性有关，酵母菌群落的变化一定条件下也反映了桃树的生长状况。
图 2 种水平上不同树龄根际及非根际酵母菌种群结构
Fig. 2 The community structure of rhizosphere and non-rhizosphere yeast at different tree age at species level
比较不同桃树树龄酵母菌多样性，结果如表2所示，不同树龄间只有3种共同的种：异常威克汉姆酵母， W. pijperi和戴尔凯氏有孢圆酵母。8年树龄与15年树龄相比，共同种有4个种异常威克汉姆酵母， W. pijperi，戴尔凯氏有孢圆酵母和白地霉。3年树龄与15年树龄酵母菌多样性相比，共同种有5个种，包括异常威克汉姆酵母， W. pijperi，戴尔凯氏有孢圆酵母， V. albida和G. pseudocandidum等。树龄增加则共同种多样性也随之增加，这与王海东
等[21] 研究表明菌群群落稳定性主要由共有物种的多样性变化决定、群落稳定性的维持主要依赖于共有物种的多样性增加的结果相符。 -
2.4 功能酵母的筛选
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2.4.1 富硒酵母的筛选
通过富硒酵母培养基的筛选，菌株在筛选培养基生长形态如图3所示，从129株酵母中总共筛选到21株具有富硒能力的酵母菌株，经分子生物学鉴定，21株富硒酵母菌株从属于白地霉9株， G. pseudocandidum 3株，半乳糖霉菌3株，浅白隐球酵母2株，热带假丝酵母（Candida tropicalis） 1株，W. pijperi 1株，V. albida 1株。其中优势种为白地霉，占筛选菌株45%，优势属为Galactomyces，占总筛选菌75%。朱静
等[22] 对地霉属TF与TM两株酵母菌进行研究，发现这两株菌能够发酵梨渣，增加酯类，醇类的种类以及含量，降低醛、酸类等有害物质的含量，能有效提高风味。目前对于白地霉的研究发现，其在食品、香料、饲料蛋白产生，产脂肪酶等方面有着重要作用[23] ，但富硒功能研究甚少，因此对其功能的开发和应用是将来食品及生产工艺中值得深入探究的一项工作。 -
2.4.2 产蛋白酶酵母筛选
培养基筛选菌株结果如图4所示：共分离得到的可培养酵母菌中14株菌株能在筛选培养基中分泌产生蛋白酶。通过分子鉴定发现，这14株产蛋白酶酵母菌均从属于浅白隐球酵母。这些酵母分布广泛，且能够水解蛋白质，产生水果的香气的芳香化合物，主要为乙基酯类物质和醇类物质。Singhal
等[24] 研究发现浅白隐球酵母能够产生漆酶和木聚糖酶，能够分解利用土壤中纤维素等大分子物质，因此其在桃园土壤中也普遍存在，在纸浆和造纸工业方面的运用具有极大的潜能。但其具有产蛋白酶的特性并未被发现，因此其潜在的功能急需被充分挖掘及利用，为我们的生产生活能够充分发挥价值，也为今后开发利用提供理论基础。 -
3 结 论
本试验通过传统的分离培养方法分离得到129株酵母菌菌株。通过生理生化分析和分子生物学分析，根际土壤离菌株分别从属7属8个种。非根际土壤分离菌株从属于7属11个种。组织中分离酵母菌菌株从属于4属4种。优势种分别为戴尔凯氏有孢圆酵母， W. pijperi和B. californica。由此可知，果园土壤中可培养酵母菌多样性比植物叶片中酵母菌多样性大，非根际土壤中酵母菌菌群多样性比根际土壤多样性大。对分离菌株进行功能酵母筛选得到富硒酵母21株，产蛋白酶酵母2株。结果表明，新疆桃园中蕴含丰富的酵母菌资源，而对于酵母菌功能的挖掘和应用，将有待于今后更深入的研究。
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摘要
为了探究新疆本土蟠桃园可培养酵母菌多样性，并挖掘功能酵母资源，本研究以新疆石河子蟠桃园3年、8年、15年树龄的根际和非根际土壤以及桃树叶片为材料，经过传统的分离培养方法获得可培养的酵母菌菌株，并进行形态学、生理生化以及26S rDNA的D1/D2区序列分析，共获得可培养酵母菌129株，从属于12个属17个种，其中子囊菌酵母为优势菌群，占分离属的88%，分布于威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)， Vanrija属， Barnettozyma属和有孢圆酵母属(Torulaspora)等11个属的15个种。担子菌占分离属的12%，分布于隐球酵母属（Cryptococcus）的2个种。其中优势属威克汉姆酵母属，包括异常威克汉姆酵母(W.anomalus)和W.pijperi两个种，占总比例的33%，优势种异常威克汉姆酵母所占总株数比例为17%。从可培养酵母中共筛选出23株功能酵母，其中富硒酵母21株，优势种为白地霉(Galactomyces candidum)，产蛋白酶酵母2株均属于隐球酵母属的Cryptococcus albidus。结果表明，新疆桃园中蕴含丰富的酵母菌资源，非根际土壤中的酵母多样性大于根际及叶片酵母多样性，且分离得到富硒酵母及产蛋白酶酵母。本研究挖掘了新疆本土可培养酵母菌资源，同时也为功能酵母的开发和利用提供理论指导。
Abstract
In order to explore the culturable yeast diversity and search for functional yeast resources in Shihezi, Xinjiang, China, yeast strains were obtained by traditional isolation and culture methods from the rhizosphere and non-rhizosphere soils and the flat peach leaves of the 3, 8 and 15 years. Using the morphological, physiological and biochemical methods and the sequence analysis of D1/D2 region of 26S rDNA, we obtained a total of 129 strains of culturable yeast, belonging to 12 genera and 17 species, of which ascomycete yeast was the dominant community, accounting for 88% of the isolated genera and distributed in 15 species of 11 genera. Basidiomycetes accounted for 12% of the isolated genera and distributed in two species of Cryptococcus. Among them, Wickerhamomyces, including anomalus and pijperi, accounted for 33% of the total, and the dominant species W. anomalu accounted for 17% of the total number of yeasts. A total of 23 functional yeasts were screened, including 21 selenium-enriched yeasts, the dominant species was Galactomyces candidum, and the two protease-producing yeasts belonged to C. albidus. The results showed that abundant yeast resources were contained in peach tree soil in Xinjiang. The yeast diversity in non-rhizosphere soil was greater than that in rhizosphere soil and leaves, and selenium-enriched yeast and protease-producing yeast were also isolated. The study explored the culturable yeast resources in Xinjiang and provides theoretical guidance for the development and utilization of functional yeast.
