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0 引 言
放线菌与人类的生产和生活息息相关，广泛应用的抗生素约70%是由各种放线菌所产
生[1] 。一些种类的放线菌还能生产各种酶制剂、维生素和有机酸等[2] 。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。由于抗菌药物的不合理使用甚至滥用，使得微生物的耐药性问题日趋严重[3] ，给人们的生产生活带来了很多危害，如导致超级细菌的产生。因此传统的以抑制微生物生长或直接杀死微生物而获得的抗生素无法从根本上解决微生物耐药性的问题[4] 。研究发现，生物膜（biofilm formation， BF）的形成是细菌产生耐药性的一个重要因
素[5] ，而群感效应（quorum sensing，QS）的产生则是控制生物膜形成的重要机制[6] 。不同细菌其群感效应的表现形式也不相同，例如生物发光、抗生素合成、固氮基因调控、色素产生、毒性基因表达、生物膜形成等[7] 。所以通过用不同培养基检测放线菌次生代谢中抑制群感效应的因素，找出群感效应抑制剂，有望从新的角度解决细菌耐药性问题。本研究选用放线菌TRM10325为实验材料，选取43种天然或合成的培养基，筛选抑制群感效应效果最好的发酵培养基。 -
1 材料和方法
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1.1 材料
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1.1.1 菌株
紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC12472由中国海洋大学赠送。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）标准菌株ATCC35984由上海复旦大学医学院赠送。新疆南疆地区放线菌TRM10325来自塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室。
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1.1.2 实验仪器与主要试剂
实验仪器有：电子天平（mL204/02，奥豪斯仪器（上海）有限公司）、超净工作台（SW-CJ-2F，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、锥形瓶（500 mL，四川蜀玻有限公司）、培养皿（90 mm，上海玻璃仪器厂）、摇床仪（TS-3222，上海天呈实验仪器制造有限公司）、智能光照培养箱（GTOP-3008，浙江托普仪器有限公司）、高速冷冻离心机（Multifuge XIR，赛默飞世尔科技公司）、移液枪（1 000、200、100 μL，大龙兴创实验仪器有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（HVE-50，日本Hirayama会社）、96孔板（Cell Culture cluster，Labphil Biotechnology）、紫外分光光度计（Evolution 201，Thermo Scientific）。
主要试剂有：蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、干酪素、精氨酸、脯氨酸（北京奥博星生物技术有限责任公司），葡萄糖、海藻糖、纤维素、甘露醇（生工生物工程股份有限公司），淀粉（天津市盛奥化学试剂有限公司），甘油（上海恒远生物科技有限公司），酵母膏、柠檬酸钠、KN
O3 、MgSO4 、CaSO4 、NaHCO3 、NaCl （天津市福晨化学试剂厂），CaCO3 （洛阳市化学试剂厂）。 -
1.1.3 培养基配方
合成培养基有17种，配方如下：
（1）IS
P4 ：K2 HPO4 2 g，MgSO4 2 g，淀粉10 g，NaCl 1 g，(NH4 )2 SO4 4 g，CaCO3 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（2）酪氨酸琼脂培养基（IS
P7 ）：甘油10 g，L-酪氨酸0.5 g，L-天冬酰胺1 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.05 g，微量盐1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（3）斜面保藏培养基：可溶性淀粉20 g，KN
O3 1 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（4）
T3 G：干酪素0.3 g，KNO3 2 g，MgSO4 2 g，K2 HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，NaCl 10 g，KCl 30 g，MgCl2 20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（5）淀粉酪素：淀粉10 g，水解酪素0.3 g，KN
O3 2 g，MgSO4 ·7H2 O 0.05 g，K2 HPO4 1 g，CaCO3 0.2 g，FeSO4 0.01 g，NaCl 45 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（6）G
W1 ：干酪素 0.2 g，甘露醇 1 g，NaHCO3 2 g，CaCO3 0.2 g，MgSO4 2 g，(NH4 )2 SO4 2 g，KNO3 2 g，K2 HPO4 1 g，FeSO4 0.14 g，微量盐 1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（7）海藻糖-脯氨酸：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，(N
H4 )2 SO4 1 g，CaCl2 2 g，MgSO4 ·7H2 O 1 g，NaCl 1 g，蒸馏水1 L，pH 7.2。（8）发酵B：L-天冬酰胺2 g，CaC
O3 2 g，海藻糖10 g，MgSO4 ·7H2 O 1 g，NaCl 30 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（9）TKM：甘露醇10 g，
K2 HPO4 2 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，CaCO3 2 g，NaCl 2 g，KCl 1 g，蒸馏水1 L，pH 7.5。（10）
F1 ：淀粉32 g，酪素水解物5 g，KNO3 1 g，K2 HPO4 1 g，CaCO3 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 1 g，(NH4 )2 SO4 2 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0。（11）
F8 ： 甘油 5 g，精氨酸1 g，K2 HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，CaCO3 0.5 g，微量盐1.0 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0。（12）高氏一号：淀粉20 g，KN
O3 1 g，FeSO4 0.01 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（13）GTB：干酪素0.3 g，纤维素10 g，KN
O3 1 g，K2 HPO4 2 g，KCl 2 g，MgSO4 ·7H2 O 1.6 g，蒸馏水1 L，pH 7.5~8.0。（14）GA：淀粉20 g， KN
O4 1 g，FeSO4 0.01 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（15）SCNB：淀粉20 g，干酪素1 g，KN
O3 1 g，K2 HPO4 2 g，NaCl 10 g，CaCO3 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0[8] 。（16） 甘油精氨酸： 精氨酸 2 g，甘油12 g，F
e2 (SO4 )3 0.01 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，ZnSO4 0.01 g，K2 HPO4 1 g，CuSO4 0.01 g， MnSO4 0.01 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（17）
T5 G：KNO3 2 g，K2 HPO4 2 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，CaSO4 ·7H2 O 0.1 g，CaCO3 1 g, KCl 3 g，NaCl 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.5。天然培养基有26种，配方为：
（18）YPD：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
（19）海藻糖干酪素：海藻糖10 g，干酪素0.3 g，KN
O3 0.1 g，K2 HPO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，CaCO3 0.02 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（20）IS
P2 ：酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，葡萄糖4 g，微量盐1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.2~7.4。（21）M-6：葡萄糖2 g，酵母膏2 g，牛肉膏0.5 g，CaC
O3 1 g，蒸馏水1 L，pH 9.0[8] 。（22）发酵A：葡萄糖10 g，
K2 HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 ·7H2 O 0.5 g，牛肉膏0.3 g，淀粉10 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，CaCO3 2 g，蒸馏水1 L，pH调至7.2~7.4。（23）Am6B：可溶性淀粉20 g，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，CaC
O3 5 g，海盐30 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（24）
F4 ：酸水解酪素5 g，酵母提取物5 g，柠檬酸三钠2 g，MgSO4 ·7H2 O 10 g，KCl 2 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 8.0~8.5。（25）CM：酸水解酪蛋白7.5 g，酵母提取物10 g，柠檬酸三钠3 g，MgS
O4 ·7H2 O 20 g，KCl 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（26）链霉菌培养基2号（M-IS
P2 ）：酵母提取物3 g，葡萄糖3 g，麦芽糖10 g，微量盐1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（27）
F7 ：麦芽粉5 g，酪素水解物2 g，腐植酸0.5 g，K2 HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2 O 10 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0。（28）
F9 ：酪氨酸0.5 g，天冬酰胺0.5 g，精氨酸0.5 g，酵母提取物0.5 g，葡萄糖0.5 g，K2 HPO4 2 g，MgSO4 ·7H2 O 2 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.0。（29）SFM：黄豆粉10 g，甘露醇10 g，MgC
l2 2.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（30）沙漠菌培养基：酵母粉4 g，葡萄糖4 g，麦芽粉5 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.
0[9] 。（31）IS
P6 ：蛋白胨15 g，鱼蛋白胨5 g，柠檬酸铁0.5 g，K2 HPO4 1 g，硫代硫酸钠0.08 g，酵母粉1 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。（32）M-IS
P4 ：可溶性淀粉10 g，酵母提取物0.5 g，胰蛋白胨1 g，(NH4 )2 SO4 2 g， MgSO4 ·7H2 O 1 g，K2 HPO4 1 g，NaCl 1 g，CaCO3 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.2~7.4。（33）
F3 ：甘油16 g，酪素水解物0.5 g，KNO3 6 g，K2 HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2 O 3 g，蒸馏水1 L，pH 8.0~8.5。（34）黄豆发酵培养基：黄豆粉15 g，葡萄糖4 g，蛋白胨4 g，NaCl 3 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
（35） 改良营养培养基：大豆粉3 g，葡萄糖10 g，淀粉10 g，酵母粉0.6 g，KCl 2 g，
K2 HPO4 0.5 g，NaCl 4 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5[9] 。（36）GYM：酵母提取物2 g，葡萄糖4 g，麦芽粉10 g，CaC
O3 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.5。（37）
F5 ：燕麦片20 g，酪素水解物0.5 g，K2 HPO4 10 g，MgSO4 ·7H2 O 1 g，微量盐1 mL，维生素1 mL，蒸馏水1 L，pH 8.0~8.5。（38）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖10~30 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
（39）小米培养基：小米15 g，葡萄糖5 g，蛋白胨4 g，NaCl 3 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
（40）玉米培养基：玉米粉15 g，葡萄糖5 g，蛋白胨4 g，NaCl 3 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
（41）IS
P5 ：天门冬酰胺7 g，甘油12 g，K2 HPO4 1 g，酵母膏16 g，KNO3 7 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。（42）藻类培养基（
F2 ）：可溶性淀粉2 g，酪素水解物0.5 g，蒸馏水1 L，pH 8.0~8.5。（43）沙门氏菌显色培养基（
T5 ）：葡萄糖1 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物2 g，CaCO3 1 g，NaCl 1 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.5。 -
1.2 方法
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1.2.1 放线菌10325菌株活化及发酵
菌株活化：将保藏于甘油管中的放线菌TRM10325菌液，涂布于固体高氏一号培养基上，在37 ℃恒温下倒置培养4~5 d，同时观察菌落生长情况。
种子液制备：将活化好的固体平板菌挑取单菌落，转接到装液量为150 mL的Am6种子培养基中，28 ℃，180 r/min培养5~7 d，同时观察菌体生长情况。
初始发酵条件：将培养好的种子液，按4%的接种量接种到150 mL的发酵培养基中，28 ℃、180 r/min恒温摇床培养7~10 d。
发酵液制备：将生长良好的放线菌，过纱布使菌体与发酵液分离，高速冷冻离心机12 000 r/min、4 ℃，离心20 min，取上清，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤，去除菌体后，-20 ℃保存备
用[10] 。 -
1.2.2 放线菌TRM10325发酵液抑制紫色素杆菌12472群感效应能力的检测
采用微孔板半定量
法[11] 检测10325放线菌发酵液对紫色素杆菌群感效应能力的影响，按1∶100的接种比例，将过夜培养的菌液接种至LB培养基中，振荡混匀。配制浓度为50%的发酵液与菌液的混合液，吸取200 μL混合液至96孔板中，每种接种4孔。每一培养板中同时设未处理组（等体积的12472菌液）与空白对照组（等体积的LB培养基）各4孔。30 ℃静置培养24 h后测OD590 nm ，同时观察紫色杆菌素的产生情况。所有QS检测实验均在不同时间重复3次。 -
1.2.3 紫色杆菌素定量方法
按Cho
o[12] 文献中的方法定量紫色杆菌素：吸取0.8 mL培养好的菌液到1.5 mL离心管中，13 000 r/min 离心10 min，使紫色杆菌素和菌体充分沉淀。去掉上清，加0.8 mL二甲基亚砜(DMSO)于离心管中，涡旋振荡，使紫色杆菌素充分溶解于DMSO中。13 000 r/min 再次离心10 min，沉淀菌体及碎屑。测定上清OD585 nm 处的光吸收值。紫色杆菌素产生能力（%）=（处理组O
D585 nm /未处理组OD585 nm )×100%。 -
1.2.4 放线菌TRM10325发酵液抑制表皮葡萄球菌35984生物膜形成能力的检测
采用微孔板半定量
法[11] 检测放线菌发酵液对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响，按1∶100的接种比例，将过夜培养的表皮葡萄球菌菌液接种至TSB培养基中，振荡混匀。配制浓度为50%的发酵液与菌液的混合液，吸取200 μL混合液至96孔板中，每株接种4孔。每一培养板中同时设未处理组（等体积的35984菌液）和空白对照组（等体积的TSB培养基）各4孔。37 ℃静置培养24 h后测OD590 nm ，无菌水洗去未黏附细菌。56 ℃烘干固定1 h，利用0.5%结晶紫染色5 min，冲洗后晾干，测OD490 nm 。相对生物膜形成能力（%）=（处理组OD490 nm /未处理组OD490 nm )×100%。所有BF形成检测实验均在不同时间重复3次。 -
2 结 果
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2.1 17种合成培养基对放线菌TRM10325抑制群感效应的影响
选取分离自新疆南疆地区连作棉田的土壤放线菌TRM10325，采用微孔板半定量法筛选抑制紫色素杆菌群感效应和表皮葡萄球菌生物膜形成的合成培养基。17种合成培养基的主要成分及TRM10325在其中的生物量如表1所示。
表1 17种合成培养基主要成分及TRM10325的生物量
Table 1 The main components of 17 synthetic media and the biomass of TRM10325
培养基名称 主要成分 生物量/g· L-1 IS P4 K2 HPO4 ，MgSO4 ，淀粉，NaCl，(NH4 )2 SO4 ，CaCO3 0.40±0.01 IS P7 甘油，L⁃酪氨酸，L⁃天冬酰胺， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，微量盐0.59±0.02 斜面保藏 可溶性淀粉，KN O3 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O0.59±0.01 T3 G干酪素，KN O3 ，MgSO4 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，NaCl，KCl，MgCl2 1.55±0.11 淀粉酪素 淀粉，水解酪素，KN O3 ，MgSO4 ·7H2 O，K2 HPO4 ，CaCO3 ，FeSO4 ，NaCl0.28±0.01 G W1 干酪素，甘露醇，NaHC O3 ，CaCO3 ，MgSO4 ，(NH4 )2 SO4 ，KNO3 ，K2 HPO4 ，FeSO4 ，微量盐0.27±0.01 海藻糖脯氨酸 海藻糖，脯氨酸，(N H4 )2 SO4 ，CaCl2 ，MgSO4 ·7H2 O，NaCl2.33±0.23 发酵B L⁃天冬酰胺，CaC O3 ，海藻糖，MgSO4 ·7H2 O，NaCl0.78±0.02 TKM 甘露醇， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，CaCO3 ，NaCl，KCl1.66±0.15 F1 淀粉，酪素水解物，KN O3 ，K2 HPO4 ，CaCO3 ，MgSO4 ·7H2 O，(NH4 )2 SO4 ，微量盐，维生素0.65±0.02 F8 甘油，精氨酸， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，CaCO3 ，微量盐，维生素0.31±0.01 高氏一号 淀粉，KN O3 ，FeSO4 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O0.19±0.01 GTB 干酪素，纤维素，KN O3 ，K2 HPO4 ，KCl，MgSO4 ·7H2 O0.11±0.01 GA 淀粉，KN O3 ，FeSO4 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O0.65±0.02 SCNB 淀粉，干酪素，KN O3 ，K2 HPO4 ，NaCl，CaCO3 0.32±0.01 甘油精氨酸 精氨酸，甘油，F e2 (SO4 )3 ，MgSO4 ·7H2 O，ZnSO4 ，K2 HPO4 ，CuSO4 ，MnSO4 0.51±0.01 T5 GKN O3 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，CaSO4 ·7H2 O，CaCO3 ，NaCl，KCl1.02±0.13 
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2.1.1 17种合成培养基对放线菌TRM10325抑制紫色素杆菌群感效应的影响
17种合成培养基对紫色素杆菌ATCC12472群感效应的影响如图1所示。
图1 17种合成培养基发酵10325对紫色素杆菌群感效应的影响
Fig. 1 Effects of Chromobacterium violaceum quorum sensing by 17 kinds of synthetic media fermented actinomycete TRM10325
注：a:IS
P4 ,b:ISP7 ,c:斜面保藏培养基,d:T3 G,e:淀粉酪素培养基,f:GW1 ,g:海藻糖脯氨酸培养基,h:发酵B培养基,i:TKM,j:F1 ,k:F8 ,l:高氏一号,m:GTB,n:GA,o:SCNB,p:甘油精氨酸培养基,q:T5 G,R:12472对照组,S:Am6对照组;“─” 代表抑制菌生长,“─ ─”代表促进菌生长NOTE: a:IS
P4 medium, b:ISP7 medium, c:inclined preservation medium, d:T3 G medium, e:starch casein medium, f:GW1 medium, g:trehalose proline medium, h:fermentation B medium, i:TKM medium, j:F1 medium, k:F8 medium, l:Gao's medium, m:GTB medium, n:GA medium, o:SCNB medium, p:glycerin arginine medium, q:T5 G medium, R:untreated, S:Am6 medium; “─”:inhibiting bacterial growth, “─ ─”:promoting bacterial growth结果显示,17种合成培养基中，没有发现能使紫色素杆菌产色素能力降低至30%及以下的培养基。使紫色素杆菌产色素能力下降至30%~60%之间的培养基有：IS
P7 、斜面保藏培养基、GW1 、海藻糖脯氨酸培养基、高氏一号、GA、甘油精氨酸培养基7种培养基；下降至60%~100%之间的培养基有：ISP4 、F8 2种培养基。抑制紫色素杆菌生长的培养基有：T3 G、淀粉酪素培养基、发酵B培养基、TKM、SCNB、T5 G6种培养基。促进菌生长从而促进紫色素产生的培养基有：F1 、GTB2种培养基。 -
2.1.2 17种合成培养基对放线菌TRM10325抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
17种合成培养基对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成的影响如图2所示。
图2 17种合成培养基发酵10325对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成能力的影响
Fig. 2 Effects of Staphylococcus epidermidis ATCC35984 biofilm formation by 17 kinds of synthetic media fermented TRM10325
注：a:IS
P4 ,b:ISP7 ,c:斜面保藏培养基,d:T3 G,e:淀粉酪素培养基,f:GW1 ,g:海藻糖脯氨酸培养基,h:发酵B培养基,i:TKM, j:F1 ,k:F8 ,l:高氏一号,m:GTB,n:GA,o:SCNB,p:甘油精氨酸培养基,q:T5 G,R:35984对照组,S:Am6对照组;“─”代表抑制菌生长NOTE: a:IS
P4 medium, b:ISP7 medium, c:inclined preservation medium, d:T3 G medium, e:starch casein medium, f:GW1 medium, g:trehalose proline medium, h:fermentation B medium, i:TKM medium, j:F1 medium, k:F8 medium, l:Gao's medium, m:GTB medium, n:GA medium, o:SCNB medium, p:glycerin arginine medium, q:T5 G medium, R:untreated, S:Am6 medium; “─”:inhibiting bacterial growth结果显示,17种合成培养基中，使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力下降至30%及以下的培养基有：
T3 G、GW1 、海藻糖脯氨酸培养基、F1 、GTB、甘油精氨酸培养基、T5 G7种培养基；使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力下降至30%~60%之间的培养基有：ISP7 、TKM、GA3种培养基；相对生物膜形成能力下降至60%~100%之间的培养基有：ISP4 、斜面保藏培养基、F8 、高氏一号4种培养基。抑制表皮葡萄球菌生长从而抑制生物膜形成的培养基有：淀粉酪素培养基、发酵B培养基、SCNB3种培养基。 -
2.2 26种天然培养基对放线菌TRM10325抑制群感效应的影响
选取分离自新疆南疆地区连作棉田的土壤放线菌TRM10325，采用微孔板半定量法筛选抑制紫色素杆菌群感效应和表皮葡萄球菌生物膜形成的天然培养基。26种合成培养基的主要成分及TRM10325在其中的生物量如表2所示。
表2 26种天然培养基主要成分及TRM10325的生物量
Table 2 The main components of 26 natural media and the biomass of TRM10325
培养基名称 主要成分 生物量/g· L-1 YPD 酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖 0.43±0.01 海藻糖干酪素 海藻糖，干酪素，KN O3 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，CaCO3 0.41±0.01 IS P2 酵母提取物，麦芽提取物，葡萄糖，微量盐 0.79±0.02 M⁃6 葡萄糖，酵母膏，牛肉膏，CaC O3 0.56±0.02 发酵A 葡萄糖， K2 HPO4 ，NaCl，MgSO4 ·7H2 O，牛肉膏，淀粉，酵母粉，蛋白胨，CaCO3 1.89±0.23 Am6 B 可溶性淀粉，酵母膏，葡萄糖，CaC O3 ，NaCl1.97±0.26 F4 酸水解酪素，酵母提取物，柠檬酸三钠，MgS O4 ·7H2 O，KCl，微量盐，维生素0.38±0.01 CM 酸水解酪蛋白，酵母提取物，柠檬酸三钠，MgS O4 ·7H2 O，KCl1.69±0.16 M⁃IS P2 酵母提取物，葡萄糖，麦芽糖，微量盐 1.32±0.14 F7 麦芽粉，酪素水解物，腐植酸， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，微量盐，维生素0.25±0.01 F9 酪氨酸，天冬酰氨，精氨酸，酵母提取物，葡萄糖， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，微量盐，维生素0.20±0.01 SFM 黄豆粉，甘露醇，MgC l2 0.87±0.02 沙漠菌培养基 酵母粉，葡萄糖，麦芽粉，微量盐，维生素 0.26±0.01 IS P6 蛋白胨，鱼蛋白胨，柠檬酸铁, K2 HPO4 ，硫代硫酸钠，酵母粉0.09±0.001 M⁃IS P4 淀粉，酵母提取物，胰蛋白胨，(N H4 )2 SO4 ，MgSO4 ·7H2 O，K2 HPO4 ，NaCl，CaCO3 1.07±0.15 F3 甘油，酪素水解物，KN O3 ，K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O0.24±0.01 黄豆发酵
改良营养
黄豆粉，葡萄糖，蛋白胨，NaCl
大豆粉，葡萄糖，淀粉，酵母粉，KCl，
K2 HPO4 ，NaCl1.24±0.02
2.40±0.30
GYM 酵母提取物，葡萄糖，麦芽粉，CaC O3 0.68±0.04 F5 燕麦片，酪素水解物， K2 HPO4 ，MgSO4 ·7H2 O，微量盐，维生素0.14±0.01 PDA 土豆，葡萄糖 0.84±0.17 小米 小米，葡萄糖，蛋白胨，NaCl 0.12±0.01 玉米 玉米粉，葡萄糖，蛋白胨，NaCl 1.85±0.26 IS P5 天门冬酰胺，甘油， K2 HPO4 ，酵母膏，KNO3 0.11±0.001 F2 淀粉，酪素水解物 0.10±0.001 T5 葡萄糖，胰蛋白胨，酵母提取物，CaC O3 ，NaCl0.17±0.001
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2.2.1 26种天然培养基对放线菌TRM10325抑制紫色素杆菌群感效应的影响
26种天然培养基对紫色素杆菌ATCC12472群感效应的影响如图3所示。
图3 26种天然培养基发酵10325对紫色素杆菌群感效应的影响
Fig.3 Effects of Chromobacterium violaceum quorum sensing by 26 kinds of natural media fermented TRM10325
注：a:YPD,b:海藻糖干酪素培养基,c:IS
P2 ,d:M-6,e:发酵A培养基,f:Am6B,g:F4 ,h:CM,i:M-ISP2 ,j:F7 ,k:F9 ,l:SFM,m:沙漠菌培养基,n:ISP6 ,o:M-ISP4 ,p:F3 ,q:黄豆发酵培养基,r:改良营养培养基,s:GYM,t:F5 ,u:PDA,v:小米培养基,w:玉米培养基,x:ISP5 ,y:F2 ,z:T5 ,R:12472对照组,S:Am6对照组;“─”代表抑制菌生长,“─ ─”代表促进菌生长NOTE: a:YPD medium, b:trehalose casein medium, c:IS
P2 medium, d:M-6 medium, e:fermentation A medium, f:Am6B medium, g:F4 medium, h:CM medium, i:M-ISP2 medium, j:F7 medium, k:F9 medium, l:SFM medium, m:desert bacteria medium, n:ISP6 medium, o:M-ISP4 medium, p:F3 medium, q:soybean fermentation medium, r:improved nutrition medium, s:GYM medium, t:F5 medium, u:PDA medium, v:millet medium, w:corn medium, x:ISP5 medium, y:F2 medium, z:T5 medium, R:untreated, S:Am6 medium; “─”:inhibiting bacterial growth, “─ ─”:promoting bacterial growth结果显示：26种天然培养基中，使紫色素杆菌产色素能力下降至30%及以下的培养基有：IS
P2 、SFM、ISP6 、GYM、F2 、T5 6种培养基；下降至30%~60%之间的培养基有：Am6B、F9 、沙漠菌培养基、黄豆发酵培养基、改良营养培养基、PDA、ISP5 7种培养基；紫色素杆菌产色素能力在60%~100%之间的培养基有：M-6、发酵A培养基、F7 3种培养基。抑制紫色素杆菌生长的培养基有：F4 、CM、M-ISP2 、M-ISP4 、F3 、F5 、小米培养基7种培养基。促进菌生长从而促进紫色素产生的培养基有：YPD、海藻糖干酪素培养基、玉米培养基3种培养基。 -
2.2.2 26种天然培养基对放线菌TRM10325抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
26种天然培养基对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成的影响结果如图4所示：26种天然培养基中，使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力下降至30%及以下的培养基有：M-6、Am6B、
F4 、M-ISP2 、F9 、沙漠菌培养基、改良营养培养基、F5 、小米培养基9种培养基；使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力下降至30%~60%之间的培养基有：发酵A培养基、CM、F7 、GYM、ISP5 、T5 6种培养基；相对生物膜形成能力下降至60%~100%之间的培养基有：ISP2 、F3 、玉米培养基3种培养基。抑制表皮葡萄球菌生长从而抑制生物膜形成的培养基有：YPD、海藻糖干酪素培养基、SFM、ISP6 、黄豆发酵培养基、PDA、F2 7种培养基；M-ISP4 培养基促进菌体生长从而促进生物膜形成。
图4 26种天然培养基发酵10325对表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成能力的影响
Fig. 4 Effects of Staphylococcus epidermidis ATCC35984 biofilm formation by 26 kinds of natural media fermented TRM10325
注：a:YPD,b:海藻糖干酪素培养基,c:IS
P2 ,d:M-6,e:发酵A培养基,f:Am6B,g:F4 ,h:CM,i:M-ISP2 ,j:F7 ,k:F9 ,l:SFM,m:沙漠菌培养基,n:ISP6 ,o:M-ISP4 ,p:F3 ,q:黄豆发酵培养基,r:改良营养培养基,s:GYM,t:F5 ,u:PDA,v:小米培养基,w:玉米培养基,x:ISP5 ,y:F2 ,z:T5 ,R:35984对照组,S:Am6对照组;“─”代表抑制菌生长,“─ ─”代表促进菌生长NOTE: a:YPD medium, b:trehalose casein medium, c:IS
P2 medium, d:M-6 medium, e:fermentation A medium, f:Am6B medium, g:F4 medium, h:CM medium, i:M-ISP2 medium, j:F7 medium, k:F9 medium, l:SFM medium, m:desert bacterial medium, n:ISP6 medium, o:M-ISP4 medium, p:F3 medium, q:soybean fermentation medium, r:improved nutrition medium, s:GYM medium, t:F5 medium, u:PDA medium, v:millet medium, w:corn medium, x:ISP5 medium, y:F2 medium, z:T5 medium, R:untreated, S:Am6 medium; “─”:inhibiting bacterial growth, “─ ─”:promotinge bacterial growth -
3 讨 论
本研究选取17种合成培养基、26种天然培养基发酵本实验室从新疆南疆地区连作棉田土壤中分离鉴定的放线菌TRM10325（灰色链霉菌）。采用微孔板半定量法，检测由合成或天然培养基发酵10325后，其发酵液抑制紫色素杆菌ATCC12472群感效应和表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜形成的情况，从而找到次生代谢产物抑制群感效应效果最好的发酵培养基。
从实验结果可知，不同培养基发酵10325后，其发酵液对两种指示菌的群感效应产生不同影响。17种合成培养基中，淀粉酪素培养基、发酵B培养基、SCNB3种培养基既抑制紫色素杆菌又抑制表皮葡萄球菌的生长；而
T3 G、TKM、T5 G只抑制紫色素杆菌生长。在17种合成培养基中，没有发现对紫色素杆菌产色素能力有强抑制作用的培养基，但有7种培养基对表皮葡萄球菌生物膜形成能力有强抑制作用，占所检测合成培养基的41%。在26种天然培养基中，发现有6种培养基对紫色素杆菌产色素能力有强抑制作用，占所检测天然培养基总数的23%；有9种培养基对表皮葡萄球菌生物膜形成能力有强抑制作用，占所检测天然培养基的35%。上述结果说明天然培养基比合成培养基更有利于10325菌株发酵产生抑制紫色素杆菌产色素的活性物质。但在10325菌株发酵产生抑制表皮葡萄球菌生物膜活性物质方面，合成培养基更有优势。本研究结果也充分说明同一株放线菌在不同配方培养基中产生的次生代谢产物不同；同一株放线菌在同一配方的培养基中对表皮葡萄球菌和紫色素杆菌群感效应的抑制效果并不相同，说明两者群感效应的物质基础不同。吴竹华等[13] 利用正交试验优化改变发酵培养基中各组分的含量，与本实验不同的是他们主要测试了同一培养基中不同的碳源和氮源对发酵的影响，使用优化后的发酵培养基明显提高了目标产物- hygrocins的产量，而本研究针对不同培养基发酵一株放线菌后，其抑制群感效应的效果发生了明显的变化，说明其代谢产物的种类或含量发生了变化。本实验为根据不同目的选择合适的发酵培养基以获得抑制不同物质基础的群感效应活性物质提供了实验依据，并为深入研究活性物质的抑制机理奠定了实验基础，有助于新型抗菌药物——群感效应抑制剂的研发。 -
参考文献
-
1
Shi N N, Sun W H, Yan J K. Preliminary establishment of marine actinomycetes [J]. ShanDong fisheries, 2015(9): 21-23.
施娜娜, 孙万辉, 严靖凯. 海洋放线菌菌种库的初步建立[J]. 齐鲁渔业, 2015(9): 21-23.
-
2
Lee J H, Kim Y G, Kim C J, et al. Indole-3-acetaldehyde from Rhodococcus sp. BFI 332 inhibits Escherichia coli O157: H7 biofilm formation [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(4): 1071-1078.
-
3
Casey G. Antibiotics and the rise of superbugs [J]. Nurs N Z, 2012, 18(10): 20-24.
-
4
Park J H, Lee J H, Kim C J, et al. Extracellular protease in actinomycete culture supernatants inhibits and detaches Staphylococcus aureus biofilm formation [J]. Biotechnol Lett, 2012, 34(4): 655-661.
-
5
Zadoks R N, Middleton J R, McDougall S, et al. Molecular epidemiology of mastitis pathogens of dairy cattle and comparative relevance to humans [J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2011, 16(4): 357-372.
-
6
Bakkiyaraj D, Pandian S K. In vitro and in vivo antibiofilm activity of a coral associated actinomycete against drug resistant Staphylococcus aureus biofilms [J]. Biofouling, 2010, 26(6): 711-717.
-
7
Swift S, Allan Downie J, Whitehead N A , et al. Quorum sensing as a population-density-dependent determinant of bacterial physiology [M]
//Swift S, Allan Downie J, Whitehead N A,et al. eds. Advances in Microbial Physiology. Elsevier, 2001: 199-270.
-
8
Liao Q Y, Wang Z Y, Li W J, et al. Secondary metabolites of alkalitolerant Streptomyces sindenensis OUCMDZ-1368 [J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2015, 40(1): 19-27,50.
廖庆云,王智颖,李文均，等. 耐碱放线菌Streptomyces sindenensis OUCMDZ-1368的次生代谢产物研究[J]. 中国抗生素杂志,2015, 40(1): 19-27，50.
-
9
Li W. The secondary metabolites of six microbes and their bioactivity [D]. Kunming: Yunnan University, 2015
黎唯. 六株微生物的次生代谢产物及其活性研究[D].昆明：云南大学,2015.
-
10
Xie T T, Chen W. Screening of antibiofilm activity from actinomycete strains against Staphylococcus epidermidis [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2015, 37(12): 930-933.
谢婷婷, 陈伟. 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放线菌筛选及其活性研究[J]. 中国预防兽医学报, 2015, 37(12): 930-933.
-
11
Li Y, Cheng L J, Chen W. The dependent form of biofilm formation of Staphylococcus epidermidis isolated from the southern Xinjiang [J].Xinjiang Agricultural Sciences, 2015, 52(4): 754-758.
李英，成李静，陈伟. 新疆南疆地区奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成依赖型检测[J].新疆农业科学,2015,52(4): 754-758.
-
12
Choo J H, Rukayadi Y, Hwang J K. Inhibition of bacterial quorum sensing by vanilla extract [J]. Letters in Applied Microbiology, 2010, 42(6): 637-641.
-
13
Wu Z H, Wang M Y, He J. Optimization of the fermentation conditions for hygrocins production by Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 [J]. Hubei Agricultural Science, 2011, 50(22): 4596-4600.
吴竹华,王明艳,何璟.吸水链霉菌ATCC 29253产hygrocins的条件优化[J].湖北农业科学,2011, 50(22): 4596-4600.
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摘要
检测不同培养基条件下，放线菌TRM10325发酵液抑制群感效应的活性，初步了解其活性稳定性，并为筛选最优发酵培养基提供实验依据。选取17种合成培养基、26种天然培养基发酵放线菌TRM10325，采用微孔板半定量法检测其对紫色素杆菌群感效应以及表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制作用。不同配方的培养基对放线菌10325抑制群感效应活性的影响也不相同，其中Am6培养基抑制群感效应效果最佳。成分不同的培养基，明显影响微生物不同次级代谢产物的产生。同一微生物在不同培养基中发酵，其次生代谢产物的种类和含量变化很大。最终选定Am6培养基为最适发酵培养基。
Abstract
Different culture media were used to study the inhibition of quorum sensing in the crude extract of the actinomycete TRM10325 to understand its activity stability, and provide experimental basis for screening optimal fermentation medium. 17 kinds of synthetic media and 26 kinds of natural culture media were used to ferment the strain 10325. The semi-quantitative plate assay was used to detect the inhibitory effect on quorum sensing of Chromobacterium violaceum and the biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. The different formulation of the culture medium had different effects on the inhibitory effect of actinomycete TRM10325 on quorum sensing, the Am6 medium had the best inhibition effect on quorum sensing. Media with different compositions significantly affect the production of different secondary metabolites of microorganisms. The same microorganism is fermented in different media, and the types and contents of secondary metabolites vary greatly. The Am6 medium was finally selected as the optimum fermentation medium.
