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0 引 言
量子点（quantum dots, QDs）是近几年来发展迅速的一种用作标记、成像、识别等多种用途的荧光纳米晶体。 它的粒子直径一般在0~100 nm，由第二主族到第六主族或者第三副族到第五副族的金属和非金属元素组成，据报道最常见量子点有CdSe、ZnS、CdS等
[1] 。随着纳米生物技术的出现，纳米微粒的微生物合成已成为“绿色化学”方法，具有环境友好特性。通过微生物合成不同金属量子点已有报道，例如Ag、Au、Cd、Zn和Pb[2,3,4,5,6] 等量子点可以通过不同微生物在细胞内和细胞外生物合成。文献报道金属硫化物纳米粒子如ZnS，CdS和PbS也可以通过细菌、真菌和酵母合成，其中ZnS量子点生物合成涉及的微生物种类有肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、梭菌（Clostridiaceae）且通过细胞外合成[7,8,9,10,11,12,13] 。关于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）合成ZnS量子点也有文献报道[14] ，合成的量子点具有很好的荧光强度，毒性较低，而未见白色念珠菌合成ZnS量子点相关报道。本实验室前期从南疆棉田土壤中分离得到对棉花黄萎病有生防效果的阿萨尔基亚芽胞杆菌(Bacillus axarquiensis) TUBP1，生防效果可达43.7%，经分析其拮抗菌活性成分为蛋白类，且活性成分作用机制主要是破坏病原菌（棉花黄萎病菌）细胞膜，进入细胞内引起线粒体细胞膜电位极化，使活性氧增加，从而破坏细胞，导致病原菌死
亡[15] 。生防菌能否在棉田土壤定殖是能否发挥生防效果的关键，而实时跟踪生防菌定殖动态，需要良好的检测手段，比如GFP荧光蛋白标记和量子点标记，量子点标记需要量子点具有较强的生物相容性，因此，本论文以白色念珠菌(Candida albicans) ATCC为研究对象，生物合成ZnS量子点，通过高分辨透射电镜（HR-TEM）确定最终合成的量子点粒径，荧光分光光度计来表征ZnS纳米颗粒（PL）光谱和粉末X射线衍射（XRD）光谱来对其晶体结构进行分析表征，将生物合成的ZnS量子点标记阿萨尔基亚芽胞杆菌，用于检测其后期在棉田的定殖动态规律。 -
1 材料与方法
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1.1 材料
白色念珠菌ATCC64550：由兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。
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1.2 仪器与主要试剂
Lumina荧光分光光度计（上海君翼仪器设备有限公司），PL2002电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），奥林巴斯B*53荧光显微镜（奥林巴斯），TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），BIO-RAD酶标仪（BIO-RAD公司）。
硫酸锌（天津永晟精细化工有限公司），酵母膏、蛋白胨、葡萄糖（北京奥博星生物技术有限公司），以上试剂均为分析纯。
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1.3 实验方法
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1.3.1 白色念珠菌培养
将白色念珠菌接种于SDB培养基，置于37 ℃恒温振荡器180 r/min培养72 h。菌液通过血球计数板调整浓度为每毫升5.4×1
09 CFU，备用。 -
1.3.2 硫酸锌对白色念珠菌生长的影响
取1 mL活化菌液加入到培养基中，并在37 ℃和180 r/min的转速下旋转摇床培养，间隔24 h，在无菌条件下取出3 mL白色念珠菌菌悬液，置于酶标仪590 nm检测其生长情况。
白色念珠菌ATCC培养物在SDA琼脂平板上划线并加入0、10、20、30 mmol/L的ZnS
O4 （500 mmol/L）混合均匀，37 ℃恒温箱培养72 h并观察菌落，明确白色念珠菌在硫酸锌中的耐受性。向100 mL SDB液体培养中加入500 mmol/L ZnS
O4 母液，使其终浓度分别为 0、10、20、30 mmol/L，接种1%白色念珠菌菌液，37 ℃和180 r/min培养72 h，离心收集菌体，60 ℃烘干，称量。 -
1.3.3 ZnS 量子点的合成
①白色念珠菌培养：用2 mL浓度为每毫升5.4×1
09 CFU的菌液接种100 mL的SDB培养基，置于37 ℃恒温振荡器180 r/min孵育72 h。8 000 r/min，离心10 min，弃去上清液菌体用无菌去离子水洗3次，菌体备用。②ZnS量子点的生物合成：ZnS
O4 配成1 mmol/L灭菌，在无菌条件下按照1 %接种量加入1 mL白色念珠菌混匀，然后置于37 ℃恒温振荡培养箱，180 r/min合成量子点。 -
1.3.4 ZnS 量子点合成条件优化研究
研究不同ZnS
O4 浓度（1、5、10、20、25、30 mmol/L）及培养时间（18、24、48、72、96 h）对ZnS 量子点生物合成产量的影响。 -
1.3.5 ZnS 量子点的提取
以24 h为一个间隔，在无菌条件下取出5 mL发酵液，监测细胞内和细胞外ZnS量子点的合成，将5 mL 样品收集在无菌15 mL离心管中，以8 000 r/min 离心10 min。获得的上清液用于检测细胞外ZnS量子点的合成。用3 mL无菌去离子水加入剩下的沉淀中置于－20 ℃冰箱反复冻融，并1 000 r/min离心10 min，弃去沉淀，得到的上清液监测细胞内ZnS量子点的合成。
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1.3.6 ZnS量子点的表征
①紫外可见光谱：用紫外-可见分光光度计从250~450 nm 进行监测，观测量子点的吸光度。
②透射电子显微镜：用高分辨透射电镜（HR-TEM）检测量子点大小。将20 μL的白色念珠菌ATCC细胞内提取物与10 μL 1%的磷钨酸混合并放置碳涂层的铜网上，测量合成ZnS纳米粒子的粒径。
③粉末X射线衍射（XRD）分析：将收获的白色念珠菌 ATCC培养物离心获得的沉淀物，进行冷冻干燥、粉末化并用于XRD分析。衍射图记录从0°到70°2θ计算%和d-间距（Å）的强度。
④荧光分光光度计分析：获的 ZnS量子点在200~600 nm 中记录光致发光光谱， 荧光分光光度计在激发时使用细胞内样品为280 nm和363 nm。发射光谱是记录在300到600 nm之间，监测合成量子点的最大吸收和发射峰。
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1.3.7 ZnS量子点标记阿萨尔基亚芽胞杆菌
阿萨尔基亚芽胞杆菌TUBP1由兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。将阿萨尔基亚芽胞杆菌TUBP1接种于NA培养基上，放置在37 ℃恒温箱培养48 h，调整菌悬液浓度为每毫升1×1
07 CFU。用灭菌过的竹签从培养基上挑取适量的芽胞杆菌融入无菌水中，将阿萨尔基亚芽胞杆菌菌悬液在4 000 r/min离心5~10 min，收集菌体，PBS洗涤2~3次，通过稀释平板法计数。取200 μL菌悬液加入偶联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)100 μL（浓度为1 mg/mL），搅拌15 min之后，再加入另外一种偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 100 μL（浓度为0.15 mg/mL），置于37 ℃的摇床继续反应1.5 h，以不加偶联剂者为对照组。待反应完毕后离心收集菌体，无菌水洗涤3~5遍，取500 μL菌悬液用于流式细胞仪进行定量分析。
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2 结果与分析
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2.1 ZnSO4对白色念珠菌生长的影响
不同浓度ZnS
O4 对白色念珠菌生长的影响由图1所示，在平板中加入不同浓度ZnSO4 ，并接种白色念珠菌，ZnSO4 浓度为10和20 mmol/L时白色念珠菌生长情况与对照组相比没有明显区别，这也说明低浓度ZnSO4 不影响白色念珠菌生长，但ZnSO4 的浓度为30 mmol/L时对白色念珠菌生长有一定抑制作用，因此，后期合成量子点时控制ZnSO4 浓度低于30 mmol/L（A）。由图1(B)所示，在波长590 nm 处检测含有1~30 mmol/L ZnSO4 药品浓度对白色念珠菌生长情况的影响，发现菌体生物量在72 h的时候达到了最大值，在72 h之后开始下降，部分在96 h时浓度开始慢慢回升。故白色念珠菌在含有ZnSO4 药品中生长最适浓度应为20 mmol/L，白色念珠菌生长最旺盛的时间是72 h。
图 1 ZnS
O4 对白色念珠菌生长的影响Fig.1 Effect of ZnS
O4 on cell growth of Candida albicans注：（A）白念菌在不同浓度ZnS
O4 中的耐受性,a～d培养基中ZnSO4 浓度分别为0、10、20、30 mmol/L;（B）不同浓度ZnSO4 对白色念珠菌的生长情况的影响,数值以平均值±三个不同实验的SD值表示NOTE: （A）tolerance of C. albicans in different concentrations of ZnS
O4, a-d show ZnSO4 concentrations in the media at 0、10、20、30 mmol/L; （B）effect of ZnSO4 on cell growth of C. albicans, values are expressed as mean ± SD of three different experiments -
2.2 ZnSO4对白色念珠菌生物量形成的影响
不同浓度ZnS
O4 对白色念珠菌生物量形成的影响由图2所示，在SDB液体培养中加入ZnSO4 溶液使其最终浓度为0、10、20和30 mmol/L，每隔12 h取一次样品，在4 ℃，180 r/min 离心10 min，倒掉上清液，烘干离心管中剩余沉淀，在分析天平上对剩余菌体量进行称重，发现含有0~20 mmol/L ZnSO4 药品的白色念珠菌随着浓度的增加，其生长一开始受到抑制，在20 mmol/L时，白色念珠菌生物质达到最大值，在30 mmol/L的ZnSO4 药品浓度时白色念珠菌的生长受到抑制，菌体生长量明显减少。白色念珠菌的生长周期在72 h达到顶峰，在72 h之后白色念珠菌开始凋亡，实验选用20 mmol/L作为后续实验的合成量子点的药品浓度。 -
2.3 ZnS量子点合成
不同浓度ZnS
O4 对ZnS量子点合成的影响如图3所示，用荧光分光光度计的荧光强度扫描合成出ZnS量子点的吸收峰，扫描出其在280 nm 和363 nm 有双重吸收峰。在Ex为280 nm 处扫描荧光强度远远高于在Ex为363 nm处扫描出的发射荧光，故本次实验选用 Ex 280 nm作为量子点激发波长，
图3 不同ZnS
O4 浓度对ZnS 量子点的荧光强度的影响Fig.3 Effect of different concentration of ZnS
O4 on the fluorescence intensity of ZnS quantum dots量子点的发射波长在300~600 nm间有2个吸收峰分别为380 nm和582 nm，其中582 nm荧光强度稳定，用于检测量子点合成荧光强度。ZnS
O4 浓度为1~30 mmol/L时ZnS量子点荧光强度呈现先升高再降低的趋势，其中 ZnSO4 浓度为20 mmol/L时ZnS量子点荧光强度最高。白色念珠菌培养时间不同对ZnS 量子点合成的影响，如图4所示，在ZnS
O4 浓度为20 mmol/L时，每隔12 h，用荧光分光光度计检测量子点合成的荧光强度，培养时间12~60 h期间，量子点荧光强度随着培养时间延长而增强，培养时间84~96 h时，量子点荧光强度随着培养时间延长而降低，到72 h时ZnS量子点荧光强度最高。
图4 反应时间对ZnS 量子点的荧光强度的影响
Fig.4 Effect of reaction time on the fluorescence intensity of ZnS quantum dots
由图5所示，用荧光显微镜对加入20 mmol/L ZnS
O4 的白色念珠菌和未加入药品的白色念珠菌进行荧光观察对比，发现在相同生物质接入量的条件下，未加入20 mmol/L ZnSO4 时，在相同的培养条件并没有产生荧光图5（a）而加入20 mmol/L ZnSO4 溶液的白色念珠菌产生了荧光，如图5（b），且有较强荧光强度，说明ZnS量子点合成。 -
2.4 ZnS量子点表征
使用紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计进行表征，如图6所示。结果表明ZnS量子点在348 nm 处发生断崖式的吸光度值降低，然后慢慢上升，可以证明ZnS量子点的产生，与Roussel
等[9] 报道一致。白色念珠菌在20 mmol/L ZnSO4 浓度中孵育72 h时，量子点荧光强度最大，为1.807 a.u.。随着孵化时间的增加，ZnS的细胞内产生的量子点开始减少并表现出吸光度值的下降。TEM分析显示ZnS 纳米颗粒是球形的,具有约30~80 nm 的直径(图7a)。HR-TEM显示ZnS量子点的粒径为7.06 nm，这个尺寸范围表示纳米粒子处于量子状态（<10 nm），因此可以称为量子点。
图7 ZnS量子点的HR-TEM和SAED分析
Fig.7 HR-TEM and SAED image of ZnS quantum dots
注：（a~c）ZnS 量子点的 HR-TEM 显微照片；（d~e）ZnS量子点 SAED 衍射图
NOTE: （a-c）HR-TEM image of ZnS quantum dots；（d-e）SAED patterns of ZnS quantum dots
XRD分析ZnS 量子点结果如图8所示，ZnS量子点晶体的特征峰为［111］，［220］，［311］，［331］，量子点特征峰与报道的纯方形β-ZnS量子点特征峰一致(JCPDS card no. 65-0309)，证明白色念珠菌可以合成细胞内ZnS量子点。
量子点标记阿萨尔基亚芽胞杆菌结果如图9所示，不加入偶联剂时ZnS量子点标记阿萨尔基亚芽胞杆菌标记率为12%，在ZnS量子点中加入EDC和NHS两种偶联剂，标记率为38 %，加入偶联剂后标记阿萨尔基亚芽胞杆菌效率比不加入偶联剂时高。
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3 结论与讨论
白色念珠菌培养体系中加入单一物质ZnS
O4 在温和条件中（37 °C）能合成ZnS量子点，微生物合成不同金属量子点需要考虑反应物的添加量在微生物耐受浓度范围内，白色念珠菌能耐受ZnSO4 浓度范围比较宽，Uddandarao等[16] 报道黄曲霉能耐受ZnSO4 浓度为0.5~3 mmol/L。Sandana Mala等[12] 发现，酿酒酵母MTCC 2918耐受ZnSO4 浓度高到10 mmol/L，而本实验白色念珠菌在30 mmol/L ZnSO4 中都能生长，这对提高ZnS量子点的产率有一定优势。细胞内量子点合成的速率和大小可以通过改变适当参数来调节，如调节溶液的pH，控制培养温度，金属离子/盐浓度和反应时间等。白色念珠菌菌液和ZnS
O4 孵育时间不同对ZnS量子点产率也有影响，由实验结果可得，孵育时间为12 h时 ZnS量子点开始合成，并在72 h达到最大值；但是，随着孵育时间延长至96 h，量子点合成产率降低。与Sandana等[12] 报道的酿酒酵母MTCC 2918合成ZnS 量子点时间（24 h）相比，白色念珠菌所用的时间有所延长，这或许与不同菌本身特性有关。ZnS量子点通过UV、HR-TEM、XRD等进行表征，TEM图像呈现ZnS纳米粒子是球形并且分散合理，量子点直径为7.06 nm，XRD分析 ZnS量子点特征峰在［111］，［220］，［311］，［331］，与报道的纯方形β-ZnS量子点特征峰一致(JCPDS card no.65-0309)，其中个别小峰的差异性归因于纳米晶体表面的不规则性。
通过生物合成的ZnS量子点对芽胞杆菌进行了标记，从图9可以看出，加入EDC和NHS偶联剂的样本标记效率比不加偶联剂的样本的标记效率要高，推测是因为量子点经过巯基丙酸修饰后，在量子点表面引入了羧基，粘结剂（EDC）进而可以和羧基发生反应，形成中间体，稳定的中间体和阿萨尔基亚芽胞杆菌的表面上的氨基结合导致的。
本实验证明了白色念珠能合成胞内ZnS量子点，并成功标记了生防菌阿萨尔基亚芽胞杆菌，为后期跟踪生防菌动态规律变化奠定基础。
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摘要
通过微生物合成金属量子点是目前研究的热点。本研究通过白色念珠菌合成ZnS量子点，对合成的量子点用高分辨透射电镜（HR-TEM）和X射线衍射（XRD）进行表征，用生物合成的ZnS量子点标记生防菌阿萨尔基亚芽胞杆菌，为建立生防菌阿萨尔基亚芽胞杆菌的荧光探针标记提供科学依据。实验结果表明，ZnS
Abstract
The development of reliable and eco-friendly processes for the synthesis of metal sulphide quantum dots has been considered as a major challenge in the field of nanotechnology. In the present study, ZnS quantum dots were synthesized through Candida albicans. The ZnS quantum dots were further characterized using high-resolution transmission electron microscope (HR-TEM) and X-ray diffraction (XRD). The results confirmed that intracellular ZnS quantum dots were produced by a facile procedure and freeze thaw extraction using 20 mmol/L ZnS quantum dots. The ZnS quantum dots showed surface plasmon resonance band at 348 nm. The size of ZnS quantum dots was 10 nm. Photoluminescence spectra excited at 280 nm and 363 nm revealed quantum confinement effects. Powder X-ray diffraction（XRD）analysis revealed that the nanoparticles were in the sphalerite phase. B. axarquiensis labeling efficiency was significantly higher when incubated with carbodiimine hydrochloride (EDC) and n-hydroxysuccinimide (NHS) coupling agent. ZnS quantum dots synthesized by C. albicans may have great potential in microbial labeling.
